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豌豆和蚕豆是云南省主要的小春作物，种植历史悠久，栽培范围广，在全省各地均有种植。近年来随着豌豆、蚕豆种植面积的扩大和种植模式的改变，病毒病成为影响豌豆、蚕豆生长发育的重要病害。长期以来，由于云南豌豆和蚕豆病毒病的病毒种类及其优势种仍不甚清楚，影响了对病毒病的有效防控。2021年以来，本实验室对云南省昆明市、玉溪市、保山市、楚雄州、大理州、红河州6个地区的豌豆、蚕豆主要种植区进行病毒病调查，将采集到表现为不同症状的74个豌豆、65个蚕豆样品进行高通量测序（High-throughput sequencing），发现云南省豌豆、蚕豆上可能存在22种已知病毒和1个耳突花叶病毒属新病毒，本实验室前期已完成对云南省主要豌豆、蚕豆种植区采集的261份豌豆和164份蚕豆样品中10种病毒的发生与分布分析。本研究在此基础上继续对261份豌豆和164份蚕豆样品中其余的12种已知病毒和1种新病毒开展检测和鉴定，旨在全面探清云南省豌豆、蚕豆上的病毒种类及其发生与分布情况，并尝试建立在豌豆和蚕豆上均普遍发生为害病毒的多重RT-PCR检测体系，为云南省豌豆、蚕豆上的相关病毒病监测、预警与综合防控提供理论依据和技术支持。具体研究结果如下：

通过高通量测序技术在昆明市寻甸县豌豆上发现一个疑似耳突花叶病毒属新病毒，将其命名为豌豆耳突花叶病毒3号（Pea enamovirus 3，PEnV-3）YWD分离物，依据ICTV最新的病毒双名法命名规则提议将其物种名称命名为Enamovirus pisi（豌豆耳突花叶病毒）。利用常规RT-PCR和RACE技术对其进行验证和全基因组序列扩增，最终获得PEnV-3 YWD分离物近全长基因组序列5758 nt。PEnV-3 YWD分离物具有典型的耳突花叶病毒属特征，5个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）与耳突花叶病毒属其他成员对应ORF的编码产物氨基酸序列一致性为16.99%~83.07%。依据Solemoviridae成员的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）构建系统发育树，发现PEnV-3 YWD分离物与耳突花叶病毒属的菜豆耳突花叶病毒1号（Bean enamovirus 1，BEnV-1）聚在同一分枝，亲缘关系较近。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses）报告中耳突花叶病毒属的新种划分标准，确定PEnV-3 YWD分离物为耳突花叶病毒属的新成员。目前该病毒仅在昆明市寻甸县的豌豆、蚕豆上检测到。

依据高通量测序结果，对2021年云南省昆明市、玉溪市、保山市、楚雄州、大理州、红河州6个地区采集的261份豌豆和164份蚕豆样品共计425份疑似病毒病样品进行13种病毒的检测。在豌豆上检测到PEnV-3、鬼针草斑驳病毒（Bidens mottle virus，BiMoV）、三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus，ClYVV）、辣椒脉黄化病毒1号（Pepper vein yellows virus 1，PeVYV-1）、番茄黄斑伴随病毒（Tomato yellow mottle-associated virus，TYMaV）、芜菁黄化病毒（Turnip yellows virus，TuYV）、烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus，TVDV）和野豌豆隐潜病毒（Vicia cryptic virus，VCV）共8种病毒，其中PeVYV-1的平均检出率最高，为27.59%。在蚕豆上检测到PeVYV-1、PEnV-3、BiMoV、ClYVV、TYMaV、TVDV、VCV共7种病毒，同样也是PeVYV-1的平均检出率最高，达45.12%。结合本实验室前期在同一批豌豆、蚕豆样品中10种病毒的检测结果，发现当前云南省豌豆上共存在18种病毒的为害，优势病毒为豌豆耳突花叶病毒1号（Pea enation mosaic virus 1，PEMV-1），平均检出率为54.02%，ClYVV的检出率最低，为0.38 %。PEMV-1、豌豆种传花叶病毒（Pea seed-borne mosaic virus，PSbMV）、菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）、芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus，BrYV）、鹰嘴豆褪绿丛矮病毒（Chickpea chlorotic stunt virus，CpCSV）在云南省豌豆上分布最广，采集样品的6个地区均有发生。昆明市豌豆病毒种类最为丰富，共检测到15种病毒，红河州豌豆上病毒最少，共检测到9种。当前云南蚕豆上共存在17种病毒的侵染，优势病毒为BYMV，检出率为81.10%，TYMaV的检出率最低，为1.83%。BYMV与PSbMV在蚕豆上分布较广，昆明市、玉溪市、保山市、楚雄州、大理州5个地区均有发生。大理州蚕豆病毒种类最为丰富，共检测到15种病毒，而红河州蚕豆病毒最少，仅检测到BrYV。18种豌豆病毒共存在148种复合侵染类型，以PEMV-1+BrYV为主，复合侵染率为3.45%；17种蚕豆病毒共存在102种复合侵染类型，主要以TVDV+PeVYV-1+BYMV、TVDV+PeVYV-1+BYMV+BrYV为主，复合侵染率均为4.27%。本研究中TYMaV、BiMoV、VCV、PEnV-3侵染豌豆为国内外首次报道，TuYV侵染豌豆为国内首次报道，ClYVV侵染豌豆为云南省首次报道。TYMaV、PEnV-3侵染蚕豆为国内外首次报道，BiMoV侵染蚕豆为中国首次报道，VCV、ClYVV侵染蚕豆为云南省首次报道。

成功建立了豌豆和蚕豆上均普遍发生为害的PEMV-1、BYMV、BrYV多重RT-PCR检测体系，检测灵敏度为0.1801 ng/µL。将该体系应用于田间豌豆、蚕豆样品PEMV-1、BYMV、BrYV检测，结果表明该体系能够高效、快速、灵敏地检测出样品中3种病毒的发生，为PEMV-1、BYMV、BrYV的检测和防治提供了技术支持。

综上所述，本研究发现了一种耳突花叶病毒属新病毒PEnV-3 YWD分离物；结合本实验室前期的工作，最终明确了当前为害云南豌豆和蚕豆的病毒种类及其发生与分布，并建立了PEMV-1、BYMV、BrYV多重RT-PCR检测体系，研究结果为云南省乃至我国豌豆、蚕豆病毒病的防控工作提供了理论依据和技术支撑。