书目详细信息
： 琉球曲霉漆酶与酪氨酸酶催化茶叶酚类物质聚合的研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 琉球曲霉漆酶与酪氨酸酶催化茶叶酚类物质聚合的研究/.刘琨毅著/.赵明指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.30 |
| 载体形态项： | 206:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2019110006 |
| 提要文摘： | 微生物发酵是国家地理标志产品普洱熟茶加工的关键工序，但目前发酵中微生物导致的酚类物质代谢与机制，尤其是微生物多酚氧化酶催化的酚类物质聚合还不清楚。本论文以从普洱熟茶发酵中分离得到的一株优势真菌P1为材料开展了四项研究：（1）菌株鉴定；（2）琉球曲霉P1强化发酵酚类物质代谢研究；（3）琉球曲霉P1强化发酵酚类物质代谢机制研究；（4）琉球曲霉漆酶与酪氨酸酶催化茶叶酚类物质聚合研究。主要结果如下。 （1）菌株P1的鉴定 通过菌落与显微形态观察、以及ITS序列系统发育分析，初步将P1鉴定为曲霉属黑色组（Aspergillus?sect. Nigri）真菌，进一步通过曲霉属黑色组模式菌株BenA与CaM基因序列的系统发育分析，将菌株P1鉴定为琉球曲霉P1（A. luchuensis?P1）。 （2）琉球曲霉P1强化发酵酚类物质代谢研究 分别应用琉球曲霉P1强化发酵（enhanced fermentation，EF）普洱熟茶，以不接菌的常规发酵（normal fermentation，NF）为对照。采用平板菌落计数与荧光定量PCR分析均发现强化发酵与常规发酵第5 d琉球曲霉的数量均达到最高值，且EF5琉球曲霉的数量显著高于NF5（P ＜ 0.05），随后琉球曲霉数量均降低。测定发现随着发酵进行，水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、茶红素的含量均显著降低（P?＜ 0.05），茶褐素含量显著增加（P?＜ 0.05），可溶性糖和茶黄素的含量先升高后降低。比较发现，强化发酵20 d样品（EF20）茶多酚、8种儿茶素、2种黄酮和没食子酸、以及222种酚类物质含量显著低于常规发酵20 d样品（NF20）；而茶褐素含量是NF20的1.99倍，另有120种酚类物质显著高于NF20。两种发酵与报道普洱熟茶发酵酚类代谢类似，琉球曲霉的接入促进了酚类物质的氧化聚合。 （3）琉球曲霉P1强化发酵酚类物质代谢机制研究 应用Illumina HiSeqTM 2500技术测定了发酵5 d（EF5、NF5）和20 d（EF20、NF20）样品的宏转录组。强化发酵5 d（EF5）样品中琉球曲霉（A. luchuensis）与白曲霉（A. kawachii）、法布里德巴利酵母（Debaryomyces fabryi）、黑曲霉（A. niger）、A. piperis与A. eucalypticola为优势活性微生物，而常规发酵5 d样品中优势活性微生物为法布里德巴利酵母与汉斯德巴氏酵母菌（D. hansenii）；发酵20 d样品中的优势活性微生物主要为细菌，包括凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、考克氏菌（Kocuria koreensis）、克氏葡萄球菌（Staphylococcus kloosii）、内生短杆菌（Brachybacterium endophyticum）与枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。比较发现接入的琉球曲霉成为了强化发酵5 d的优势菌，并改变了发酵微生物群落结构。 基因功能注释发现发酵中琉球曲霉、法布里德巴利酵母、白曲霉等微生物产生酶催化酚类物质代谢，包括：单宁酶、糖苷水解酶催化酚类物质水解，儿茶酚-O-甲基转移酶、糖基转移酶催化酚类物质转化，水杨酸1-单加氧酶、苯甲酸4-单加氧酶、苯酚2-单加氧酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶以及4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶、儿茶酚1,2-双加氧酶、儿茶酚2,3-双加氧酶催化酚类物质降解，过氧化氢-过氧化物酶、漆酶和酪氨酸酶催化酚类物质氧化。其中琉球曲霉的漆酶与酪氨酸酶基因在发酵中高量表达，且EF5表达量显著高于NF5（P ＜ 0.05）；EF5和EF20漆酶与酪氨酸酶的酶活均高于NF5和NF20。表明琉球曲霉在发酵中产生了漆酶与酪氨酸酶可能催化酚类物质的氧化聚合，进而形成茶褐素。 （4）琉球曲霉漆酶与酪氨酸酶催化茶叶酚类物质聚合研究 克隆得到琉球曲霉P1在发酵中表达的漆酶与酪氨酸酶基因，应用基因工程法制备得到漆酶（0.810 ± 0.185 U/mg）与酪氨酸酶（1.311 ± 0.211 U/mg），均能催化表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等儿茶素形成茶黄素与茶黄素-3-没食子酸酯等酚类聚合物；其中，酪氨酸酶催化所形成的茶黄素与茶黄素-3-没食子酸酯的相对含量高于漆酶催化。 应用漆酶与酪氨酸酶分别催化了液氮研磨晒青茶、茶多酚提取物。参考茶褐素提取方法，制备了8个酚类聚合物，包括强化发酵样品（得率为15.39%）、晒青茶（3.51%）、漆酶催化晒青茶（7.24%）、漆酶催化茶多酚提取物（29.66%）、酪氨酸酶催化晒青茶（7.95%）、酪氨酸酶催化茶多酚提取物（32.40%），以及不加酶催化的晒青茶（3.86%）与茶多酚提取物（16.02%），发酵或催化后得率升高，表明发酵与酶催化增加了聚合物的含量。 凝胶渗透色谱法发现聚合物中21.12%~44.44%相对分子量高于1,000 Da；扫描电子显微镜法、原子力显微镜等分析发现强化发酵样品聚合物聚合程度更高，表面光滑、裂块较少；紫外可见吸收光谱法、傅里叶变换红外光谱法分析发现强化发酵聚合物的酚羟基含量增加，热裂解气相色谱法在聚合物中鉴定了咖啡因、异佛尔酮等。酪氨酸酶与漆酶催化晒青茶形成的聚合物聚合度显著高于对照，酚羟基含量增加，聚合物中鉴定了咖啡因、1,3-丙二醇等。酪氨酸酶形成的聚合物聚合度高于漆酶催化，且酪氨酸酶催化晒青茶形成的聚合物与强化发酵形成的茶褐素外观与裂解产物更类似，证实了发酵中琉球曲霉分泌的酪氨酸酶催化酚类物质可形成茶褐素。 综上，本论文研究发现琉球曲霉接菌发酵时迅速生长成为发酵初期的优势菌，与法布里德巴利酵母、白曲霉等微生物共同产生漆酶、酪氨酸酶、单宁酶等酶，催化发酵中酚类物质的水解、转化、降解、氧化；琉球曲霉漆酶、酪氨酸酶催化酚类物质可形成与茶褐素近似的聚合物。相关结果丰富了普洱熟茶发酵中酚类物质代谢、茶褐素形成机制知识。 |
| 并列题名： | The Polymerization of Tea Polyphenols Catalyzed by Laccase and Tyrosinase of Aspergillus luchuensis eng |
| 题名主题： | 琉球曲霉 漆酶 酪氨酸酶 酚类物质 聚合物 学位论文 |
| 中图分类： | TS272-533 |
| 个人名称等同： | 刘琨毅 著 |
| 个人名称次要： | 赵明 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |