书目详细信息
： 解脂耶氏酵母高产抗抑郁单体苔黑酚葡萄糖苷
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 解脂耶氏酵母高产抗抑郁单体苔黑酚葡萄糖苷/.陈碧环著/.字淑慧，张广辉指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.25 |
| 载体形态项： | 69页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2020210171 |
| 提要文摘： | 抑郁症是一种发病率极高、危害严重的精神类疾病，由于化学药物治疗具有较强的副作用，研究人员开始转向抗抑郁植物天然药物的开发。苔黑酚葡萄糖苷(Orcinol glucoside，OG)是药用植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)根茎中的一种酚苷类化合物，现代研究表明OG具有抗抑郁、抗焦虑、抗骨质疏松、抗氧化、神经保护和免疫调节等多种药理活性。由于OG抗抑郁疗效显著、作用机制新颖、具有抗应激和调控突触可塑性等特点，已经作为I类新药在中国进行临床研究。然而，目前OG的生产方式主要依赖于植物提取或化学合成，生产能力受到极大限制。随着生物信息学与合成生物学的发展，解析OG生物合成路线，开发微生物细胞工厂，促进OG的高效生物合成，具有低成本、效率高、环境友好等优势，可以有效地促进OG的产业化应用。 推测OG的生物合成路径首先由苔黑酚合酶(Orcinol synthase，ORS)催化1分子乙酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A缩合生成苔黑酚，苔黑酚再经过糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)的糖基化修饰生成苔黑酚葡萄糖苷。先前报道中，仅兴安杜鹃来源的RdauORS能够催化苔黑酚生成，然而副产物众多、催化效率较低。与此同时，仙茅中的ORS和UGT尚未被挖掘。因此，本研究基于仙茅转录组测序、生物信息学分析、计算虚拟筛选、酶学功能表征，获得OG合成途径中的关键基因ORS和UGT，成功解析OG生物合成路径。随后，通过解脂耶氏酵母细胞工厂构建、代谢工程改造和发酵优化实现OG的高效生物合成。具体研究内容如下： (1)首先，基于仙茅根和叶的转录组数据进行生物信息学分析。获得68,963条unigenes，在六大数据库中一共注释到29,328条unigenes。挖掘到可能参与苔黑酚葡萄糖苷生物合成的3个ORS候选序列和71个UGT候选序列。 (2)其次，通过体外功能表征和解脂耶氏酵母发酵实验，成功鉴定了3个具有催化活性的ORS。发酵结果表明仙茅来源的CorcORS1催化苔黑酚产量最高，为431.06 mg/L，是马缨杜鹃来源的RdelORS1的5.9倍，是已报道安杜鹃来源的RdauORS的9.93倍。此外，基于催化口袋活性分析和I256V和F267Y突变实验，发现I256和F267是CorcORS1高活性的关键氨基酸残基。 (3)另外，建立了一条高效的UGT计算虚拟筛选策略，结合基因表达量和分子对接从仙茅71个UGT中划定了6个候选基因，通过体外酶活性测定，成功获得3个仙茅来源的具有催化苔黑酚糖基化功能基因CorcUGT31、CorcUGT32和CorcUGT71，其中CorcUGT31的转化率高达96%。 (4)随后，通过CRISPR-Cas9系统将密码子优化后的CorcORS1和CorcUGT31进行解脂耶氏酵母无标记整合，首次实现OG的从头合成(0.44 g/L)；通过过表达YlACC1和/或YlPEX10增加前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A通量，OG产量无明显增加，表明现阶段前体物质并非限速步骤；采用多轮集成优化关键基因拷贝数，使得OG产量明显提高，研究结果表明增加4轮CorcORS1和CorcUGT31基因拷贝数为最佳组合(2.26 g/L)。 (5)最后，为进一步提高OG产量，通过形态、培养基和发酵条件优化，在1.3 L生物反应器中发酵108 h后OG最高产量达到43.46 g/L(0.84 g/g DCW)，是植物提取的6400倍。 综上所述，本研究建立了一种利用解脂耶氏酵母细胞工厂绿色高效生产抗抑郁单体OG的生产模式，为大规模发酵生产OG奠定了坚实基础，也为快速高效解析天然产物的生物合成途径和其它酚苷类化合物的微生物重组合成提供了参考。 |
| 并列题名： | High-level Production of the Antidepressant Orcinol glucoside in Yarrowia lipolytica |
| 题名主题： | 苔黑酚葡萄糖苷 苔黑酚合酶 糖基转移酶 解脂耶氏酵母 合成生物学 学位论文 |
| 中图分类： | R282-533 |
| 个人名称等同： | 陈碧环 著 |
| 个人名称次要： | 字淑慧 指导 |
| 个人名称次要： | 张广辉 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |