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： 辣木叶致敏蛋白的分离纯化、三维结构及其特性研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 辣木叶致敏蛋白的分离纯化、三维结构及其特性研究/.李文杰著/.田洋， 宋爽指导 |
| 出版发行项： | 2023.06.17 |
| 载体形态项： | 86页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2021240080 |
| 提要文摘： | 辣木叶富含多种营养物质，新鲜的辣木叶常被用作特色菜的食材，辣木叶干粉也可用作食品原料。辣木叶食物过敏现象在云南广西等盛产辣木的地区经常发生，本课题组前期研究中也发现辣木叶蛋白可在有佐剂或无佐剂的条件下导致小鼠过敏，发现粗致敏蛋白中36 kDa的蛋白有致敏性。本研究主要对36 kDa的致敏蛋白进行分离纯化，研究热处理对辣木叶致敏蛋白过敏活性的影响，通过生物信息学预测辣木叶致敏蛋白的功能和结构，最后对扩增的过敏基因进行体外原核表达。 本研究使用新鲜辣木叶提取辣木叶粗致敏蛋白，通过阴离子交换柱-Sephadex G-75凝胶柱-超滤三步法、阳离子交换柱-超滤两步法和反相色谱法分别对辣木叶粗致敏蛋白进行分离纯化，借助SDS-PAGE、血凝滴定和Western blot等技术对上述三个方法得到的致敏蛋白进行凝血和过敏活性的分析。为探究致敏蛋白的热稳定性，通过模拟炖煮的方式处理致敏蛋白，对热处理后致敏蛋白的凝血和过敏活性进行研究，此外，本研究还通过粒径和zeta电位、总巯基含量、溶解度和表面疏水性的变化，以及紫外光谱、固有荧光光谱和聚集程度的变化，来分析热处理对致敏蛋白理化和结构的影响；使用胃蛋白酶和胰蛋白酶对致敏蛋白进行体外模拟消化，并检测消化率。 通过电喷雾质谱分析36 kDa致敏蛋白的组成成分，测得含量最高的为果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA），并在NCBI数据库检索其序列信息，通过基因调取实验补全序列信息。通过ExPASy、Novopro、TMHMM-2.0、IEDB、PSIPRED、SOPMA、BioEdit、I-TASSER、SWISS-MODEL和ConSurf等生物信息学在线服务程序和软件对致敏蛋白的功能、结构和同源性进行预测分析。 使用pET-28a（+）载体与扩增的FBA基因结合组成重组质粒，然后将质粒转入BL 21感受态细胞中转化，选择转化后生长较好的菌落进行培养，之后加入IPTG进行诱导和破碎提取，将提取的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的条带和致敏性。 主要研究结果如下： 1、新鲜辣木叶粗致敏蛋白的分离纯化：粗致敏蛋白的提取率为12.78 mg/g；Western blot实验发现粗致敏蛋白的23和36 kDa的蛋白均具有过敏活性。采用阴离子交换柱-Sephadex G-75凝胶柱-超滤三步法和反相色谱法，纯化得到了23和36 kDa的致敏蛋白（MOLa），MOLa具有凝血和过敏活性；采用阳离子交换柱-超滤两步法，得到了50-60 kDa的蛋白（MOLb），但是MOLb没有凝血和过敏活性。根据2个组分的过敏活性，选择MOLa作为原材料，进行后续研究。 2、热处理对MOLa的理化、结构和过敏活性的影响：热处理后，MOLa的凝血和过敏活性随着温度的升高不断降低至丧失；MOLa的变性温度为59.78℃，变性焓为61.4 J/g；MOLa的平均粒径、zeta电位和总巯基含量随着温度的升高而降低；溶解度先升高后降低；聚集程度和表面疏水性的变化与温度成正比；热处理后紫外光谱和固有荧光光谱的变化也显示MOLa的二级和三级结构发生了变化。这说明热处理后辣木叶MOLa的理化和结构都发生了不同程度的变化，凝血和过敏活性也逐渐降低，在温度达到100℃后丧失了活性。 3、FBA的生物信息学预测研究：选用MOLa中过敏活性较高的36 kDa的凝胶进行质谱鉴定，得到其主要成分为FBA，但是辣木叶的FBA在NCBI上的氨基酸序列只有一半，所以找到两条合适的引物进行PCR实验补全序列，得到984 bp的cDNA序列，翻译得到327个氨基酸残基；生物信息学预测表明FBA的分子量为35.54 kDa，等电点为5.80，主要为丙氨酸和亮氨酸；FBA属于亲水性肽段，没有跨膜区域，有多个抗原表位位点，3个钙结合区域，属于稳定蛋白；FBA的二级结构主要由α螺旋组成，占比可达47.7%；FBA与禾本科类植物同源性较高，与豆科和藜科类植物同源性较低；预测得到FBA的三维结构FBA 1，具有高度保守性。预测结果可以为课题组后续开展的细胞和动物实验提供理论基础。 4、FBA的体外原核表达： FBA的氨基酸序列与pET-28a（+）载体相连形成重组质粒，重组质粒成功在BL 21感受态细胞转化，选择7个长势较好的菌落进行扩大培养，IPTG诱导和超声破碎提取后，7个菌落的36 kDa目的蛋白均在SDS-PAGE电泳上显现，Western blot表明其能够特异性结合IgE，有过敏活性。成功表达重组致敏蛋白，经beads和硫酸镍纯化后，得到了纯度较高的23 kDa致敏蛋白，且其能特异性结合IgE，有致敏性。 综上所述：辣木叶中含有活性蛋白，具有凝血和过敏活性，属于致敏蛋白；通过层析法分离纯化得到了23和36 kDa的致敏蛋白（MOLa），热处理改变了MOLa的理化和结构性质，也使MOLa丧失凝血和过敏活性；36 kDa的致敏蛋白主要成分为FBA，FBA的生物信息学研究体现了FBA具有一定的致敏性；通过原核表达得到了有过敏活性的重组致敏蛋白。上述对辣木叶致敏蛋白的研究，可以为课题组后续的进一步了解辣木叶致敏蛋白提供基础，避免后续实验的盲目性。 |
| 并列题名： | Separation, Purification, three-dimensional Structure and Characterization of allergen from Moringa oleifera leaf eng |
| 题名主题： | 辣木叶致敏蛋白 分离纯化 热处理 生物信息学 原核表达 学位论文 |
| 中图分类： | TS201.4-533 |
| 个人名称等同： | 李文杰 著 |
| 个人名称次要： | 田洋 指导 |
| 个人名称次要： | 宋爽 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |