书目详细信息
： DOCA通过抑制TNF-α与TNFR结合改善类风湿性关节炎的作用及机制研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | DOCA通过抑制TNF-α与TNFR结合改善类风湿性关节炎的作用及机制研究/.干春霞著/.王宣军指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.1 |
| 载体形态项： | 85页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2020110003 |
| 提要文摘： | 类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以慢性关节炎为主要症状的自身免疫性疾病，体液免疫在RA发展过程中发挥关键作用，TNF-α是体液免疫中主要的促炎因子之一。RA患者关节滑膜液中TNF-α含量显著高于正常人群，TNF-α与其受体TNFR结合激活下游NF-κB信号通路，促进炎症基因转录，造成关节炎症持续发展。阻断TNF-α-TNFR之间的相互作用是RA治疗的重要策略，能够阻断TNF-α-TNFR结合的单抗在临床应用中疗效显著，但生物制剂分子量大，价格昂贵，因此TNF-α/TNFR小分子抑制剂研发具有重要意义。 已有研究采用虚拟数据库或组合化学方法进行TNF-α/TNFR小分子抑制剂研发，前期研究中，以TNF-α/TNFR为靶点对186种天然三萜类化合物进行筛选，发现1-脱羧-3-氧代茶酸（DOCA）能够抑制TNF-α与TNFR结合。基于此，本论文通过表面等离子共振技术（SPR）、Elisa实验、荧光素酶报告基因检测、MTT、流式细胞术、细胞免疫荧光、类风湿性关节炎小鼠模型、关节软骨染色及免疫组化分析等来探究DOCA通过抑制TNF-α与TNFR结合改善类风湿性关节炎的效应及机制。主要研究结果如下： 1. DOCA与TNF-α、TNFR1及TNFR2均有结合，能够阻断TNF-α与TNFR之间的相互作用。通过亲和力检测、竞争性实验和Elisa实验检测DOCA与TNF-α、TNFR1及TNFR2之间的相互作用关系。（1）亲和力检测实验结果表明，DOCA与TNF-α之间的结合亲和力（KD）为6.548 × 10-4 M，与TNFR1之间的KD值为8.405 × 10-6 M，与TNFR2之间的KD值为4.835 × 10-6 M，说明DOCA能与TNFR1和TNFR2直接结合，与TNF-α结合较弱。（2）竞争性结合实验结果表明，DOCA（4 μM、8 μM、16 μM）能够抑制TNF-α与TNFR1及TNFR2之间的结合，降低两者之间的结合信号值（R1：49%、68%和69%；R2：28%、39%和46%）。（3）Elisa实验结果表明，DOCA（5 μM、10 μM、20 μM）能够阻断TNF-α与TNFR1及TNFR2之间的结合，降低两者结合强度（R1：4%-78%；R2：3%-79%）。这些研究结果表明，DOCA可以与TNFR1及TNFR2高亲和力结合，阻断TNF-α与TNFR之间的相互作用。 2. DOCA能够抑制TNF-α诱导的生物学效应。由于DOCA能够阻断TNF-α与TNFR结合，采用四种细胞模型对DCOA是否影响TNF-α诱导的生物学效应进行验证。（1）L929细胞是小鼠成纤维细胞，其细胞膜表面表达TNFR，TNF-α能够诱导L929细胞凋亡，因此L929细胞常用于测定TNF-α活性。实验结果表明，TNF-α（10 ng/mL）在10小时内可显著诱导L929细胞凋亡，DOCA（6.5 μM）可显著抑制TNF-α引起的L929细胞凋亡和形态变化。（2）293（NF-κB）报告细胞中稳定转入了由NF-κB控制表达的Luciferase基因，TNF-α能够刺激293细胞中NF-κB转录活性增加，通过检测Luciferase强度能够反应NF-κB转录活性。研究结果表明，TNF-α在4小时内可显著诱导NF-κB活化（5 ng/mL和10 ng/mL），DOCA（4.5 μM、5.5 μM和6.5 μM）可显著抑制TNF-α刺激后293（NF-κB）报告细胞内NF-κB的转录活性。（3）滑膜细胞（HFLS和MH7A）是关节滑膜中的重要组成细胞，TNF-α刺激可引起HFLS和MH7A细胞中NF-κB信号活化，促进关节炎症发展。实验结果表明，TNF-α在1小时内可引HFLS和MH7A细胞中NF-κB信号活化，主要表现为NF-κB信号通路标志蛋白（IKKα/β、IκBα和p65）磷酸化水平升高，NF-κB（p65）亚基从细胞浆进入细胞核；DOCA处理可显著降低TNF-α刺激后标志蛋白的磷酸化，同时也能显著抑制TNF-α引起的p65核转位。上述研究结果表明，DOCA通过阻断TNF-α与TNFR结合，抑制其效应分子NF-κB活化。 3. DOCA在RA动物模型中具有改善类风湿性关节炎作用。以胶原诱导DBA小鼠建立的RA模型作为研究对象（Collagen-induced arthritis，CIA），参考细胞实验浓度，按6 mg/kg体重的处理剂量对小鼠连续腹腔注射23天，以阿达木单抗作为阳性对照，处理结束后对小鼠主要脏器和关节组织进行染色评价DOCA改善RA的功效。（1）通过肝肾病理切片染色分析，处理基质、DOCA及单抗均没有观察到明显的肝肾毒性；（2）脾脏是重要的免疫器官，RA发展常伴随脾肿大综合征。脾脏湿重称量结果显示，CIA小鼠脾脏湿重显著高于正常小鼠，DOCA和单抗均能减少CIA小鼠脾脏湿重（10%和15%）。免疫细胞过度增殖是RA发展的重要原因之一，脾脏H&E染色和免疫组化分析结果表明，CIA小鼠脾脏淋巴鞘生发中心大小和数量明显增加，DOCA和单抗均可减少淋巴滤泡数量和密度，并抑制脾脏中T细胞标志物CD3ε和CD4表达。（3）关节肿胀是RA发展的重要临床表现。小鼠后爪厚度测量结果显示，CIA小鼠后爪厚度显著高于正常小鼠；DOCA和单抗均可显著减少CIA小鼠后爪厚度（15%和20%）和关节炎评分（24%和36%）。（4）滑膜增生是RA发展的重要病理特征。小鼠下肢膝关节、踝关节和趾关节H&E染色结果表明，CIA小鼠关节处出现明显的滑膜增生现象，脚踝和脚掌的关节均出现严重的炎性细胞浸润和骨侵蚀症状，微观关节结构明显改变；DOCA明显减少CIA小鼠关节内部滑膜增生和细胞浸润，改善关节病理结构，单抗效果更加显著。（5）软骨流失是造成RA患者关节功能丧失的主要原因之一。番红O固绿软骨染色和甲苯胺蓝软骨染色结果表明，正常小鼠的膝关节、踝关节和趾关节表面由完整的软骨组织覆盖，着色明显，关节腔缝隙清晰未出现明显的软骨流失现象；CIA小鼠关节表面软骨破坏严重，未见番红染色或着色程度极低；DOCA和单抗均可减少CIA小鼠关节表面软骨流失，两者效果相当。（6）TNF-α可引起破骨细胞分化，在RA发展过程中造成不可逆的骨损伤。小鼠的膝关节、踝关节和趾关节TRAP染色结果显示，CIA小鼠关节骨组织破骨细胞数量显著增加；DOCA和单抗均有效减少CIA小鼠关节破骨细胞数量，两者效果类似。（7）NF-κB（p65）作为TNF-α关键效应分子，在RA的发展过程中十分重要。骨组织免疫组化染色和蛋白质免疫印迹实验结果表明，CIA小鼠关节骨组织中p-p65表达显著高于正常小鼠；DOCA和单抗均可显著抑制CIA小鼠关节骨组织中p-p65表达。（8）炎症反应是RA持续发展的重要因素。血清炎症因子检测结果证明，CIA小鼠血清中促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平明显高于正常小鼠；DOCA和单抗均能显著降低CIA小鼠血清中相关促炎因子表达，单抗效果更加显著。上述研究结果表明，DOCA能够阻断CIA小鼠关节组织中TNF-α关键效应分子NF-κB活化，在动物模型中发挥改善RA作用。 综上所述，本论文研究表明，DOCA作为一种天然化合物，能够与TNF-α和TNFR直接结合，阻断TNF-α与TNFR结合，抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路活化，发挥改善RA作用。这些研究结果为从天然化合物中获得RA治疗药物提供了新的策略，也为中药材及食药资源的应用开发提供了一定的理论基础。 |
| 并列题名： | The action of mechanism by which DOCA inhibits the TNF-α-TNFR interaction to protect against rheumatoid arthritis eng |
| 题名主题： | 1-脱羧-3-氧代茶酸 TNF-α TNFR NF-κB信号通路 类风湿性关节炎 学位论文 |
| 中图分类： | Q291-533 |
| 个人名称等同： | 干春霞 著 |
| 个人名称次要： | 王宣军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |