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： 蓝舌病病毒17型核酸标准物质的制备及BTV qRT-PCR检测方法的建立
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 蓝舌病病毒17型核酸标准物质的制备及BTV qRT-PCR检测方法的建立/.陈朝林著/.李文贵, 艾军指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.9 |
| 载体形态项： | 69页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2021240460 |
| 提要文摘： | 蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的一种通过吸血库蠓传播的虫媒病毒病，牛、羊等反刍动物对其易感，目前尚无有效的治疗方法。世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH）将BT列为法定上报的多种动物共患疫病，我国将其列为二类动物疫病。针对目前没有BTV核酸标准物质相关文献的发表，BTV核酸检测缺少全毒株这类核酸标准物质，无法对样本进行质控等问题，开展了BTV-17核酸标准物质的制备和含内参的BTV实时荧光定量RT-PCR（Real-time quantitative RT-PCR，qRT-PCR）方法的建立相关研究。 1、BTV-17核酸标准物质的制备、定值与应用 本研究对BTV-17型毒株进行增殖培养，灭活分装冻干，并采用建立的BTV?qRT-PCR对BTV-17悬浮液进行浓度检测、均匀性初检、灭活性检测，制备了BTV-17核酸标准物质；对已冻干的BTV-17核酸标准物质进行物理性状检验、灭活检验、支原体检验及纯粹性检测。随机抽取样品进行均匀性、短期稳定性及长期稳定性考察。BTV-17核酸标准物质呈黄色松散状固体。将灭活的BTV-17接种于BHK-21细胞盲传三代后，各代次细胞均无细胞病变，经qRT-PCR检测各代病毒量依次递减，说明BTV-17已经灭活。进行支原体检验，结果均为阴性。纯粹性检测除BTV-17有扩增曲线外，其他病毒均无扩增。随机抽取10瓶标准物质进行均匀性检验，结果显示样品是均匀稳定的。BTV-17核酸标准物质在-20℃、4℃、25℃、37℃条件下，可存放9天；在-80℃、-20℃、4℃、25℃条件下均没有显著差异，均可存放6个月。BTV-17核酸标准物质在定值时采用多个实验室合作定值的方式，协同3家实验室进行协作定值，同时对多家定值的数据进行统计分析。将均匀性、稳定性以及定值过程中的不确定度进行统计分析，得出BTV-17核酸标准物质的标准值为9.15×106?copies/μL，扩展标准不确定度（k=2）为5.55×105?copies/μL，最终BTV-17核酸标准物质的表示结果为（9.15±0.56）×106?copies/μL。 2、含内参基因的BTV?qRT-PCR方法的建立 参考2022年世界动物卫生组织《陆生动物诊断与疫苗陆地手册》中针对BTV NS3基因的特异性引物和探针，同时设计了一对内参基因GAPDH引物和探针，构建标准品pUC57-BTV-NS3和pUC57-GAPDH，分别用于qRT-PCR中NS3基因及内参基因GAPDH标准曲线的构建。通过对反应条件进行优化，建立了以GAPDH为内参基因的检测BTV qRT-PCR方法。结果显示，建立的方法与流行性出血病病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、小反刍病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、水泡性口炎病毒不存在交叉反应，具有良好的特异性，该方法检测BTV和GAPDH阳性质粒标准品的最低检出量分别6.685?copies/μL、1.9×102?copies/μL，BTV检测Ct值的组内和组间变异系数均小于1.2%，GAPDH检测Ct值的组内和组间变异系数均小于0.7%，具有较好的重复性。采用建立的BTV?qRT-PCR方法对88份实验室保存的羊血清样品进行检测，阳性率为4.55%，并与WOAH推荐的检测BTV的套式PCR进行比较，结果表明两种方法检测结果符合率为100%，但qRT-PCR方法操作更为简便，结果准确，更适用于大量临床样品的检测。 综上所述，本研究制备了BTV-17核酸标准物质，对该标准物质进行协作定值，提供可靠的参考值；建立了含内参基因的BTV qRT-PCR检测方法，加入内参基因对样本进行质控，提升了检测的准确性。本研究有利于完善BTV核酸检测体系，推动BT检测方法的标准化。 |
| 并列题名： | Preparation of nucleic acid reference material for Bluetongue virus type 17 and establishment of BTV qRT-PCR assay eng |
| 题名主题： | 蓝舌病病毒 核酸标准物质 qRT-PCR 内参基因 学位论文 |
| 中图分类： | S855.3-533 |
| 个人名称等同： | 陈朝林 著 |
| 个人名称次要： | 李文贵 指导 |
| 个人名称次要： | 艾军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |