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（1）Hcp1基因的缺失：以菌株W24设计并合成1对sgRNA靶向 Hcp1，PCR扩增sgRNA表达盒（J23119promoter、N20和sgRNA scaffold序列）；以W24基因组分别扩增左、右修复模板，使用OverlapPCR将其连接得到683bp的Donor，再分别酶连至pUC19载体构建双靶点载体pUC-spacer-Donor；首先将pCas质粒电转化至W24，经L-(+)-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，再电转pUC-spacer-Donor质粒获得Hcp1全基因缺失株ΔHcp1，共缺失523bp（Hcp1编码区483bp及上游非编码区40bp）。
（2）E.coli Hcp1的致病性：将昆明小鼠分成4组：生理盐水组、LPS组、W24组和ΔHcp1组（n=15）。相对于对照组，各组小鼠精神萎靡，12h症状加重且体温达峰值，ΔHcp1组与W24组无明显差异。剖检小鼠发现实验组肠壁菲薄，各器官可见出血点。相对于对照组，肝脏指数增加（p<0.01），肝脏显著肿大，但肾脏差异不显著。生化分析发现W24组促进肝肾功能损伤，但在ΔHcp1组这种现象减轻，血清AST、ALT、CRE 和 BUN显著变化证明了这一点（p<0.01）。与对照组相比，H&E显示肝脏淤血，结构破坏严重，细胞损伤，炎性细胞侵润；而肾脏发生出血，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔内充满浆液，炎性细胞等；TEM发现肾小管上皮细胞损伤严重，细胞器被破坏；在肝细胞中观察到同样的现象，W24组小鼠较ΔHcp1组症状更为严重。IHC显示，缺失Hcp1后，IL-1β和IL-18在肝细胞和肾小管上皮细胞中较W24组表达显著降低（p<0.01）。提示Hcp1参与E.coli感染宿主的过程，具有毒力作用，增强E.coli的致病性，造成小鼠急性肝损伤（Acute Liver injury，ALI）和AKI。

大肠杆菌病严重威胁世界各地仔猪的健康养殖。溶血素协同调节蛋白1（haemolysin co-regulated protein，Hcp 1）是VI型分泌系统（Type VI Secretion System，T6SS）的重要效应蛋白，能增强细菌的毒力，引起细胞损伤乃至死亡。本研究首次运用CRISPR系统构建E.coli临床分离株W24 Hcp1全基因缺失株，通过体内实验将E.coli腹腔注射至昆明小鼠，运用生化分析、IHC、H&E和TEM 等技术探讨E.coli Hcp1对小鼠的致病性。在此基础上进一步分析E.coli Hcp 1造成急性肾损伤（Acute kidney injury，AKI）的分子机制，利用多种分子生物技术分析Hcp1在肾小管上皮细胞中对焦亡经典通路NLRP3/cspase-1的影响，同时旨在探讨Hcp1在E.coli中的毒性作用及造成细胞焦亡从而促进AKI发生的机制。
（1）Hcp1基因的缺失：以菌株W24设计并合成1对sgRNA靶向 Hcp1，PCR扩增sgRNA表达盒（J23119promoter、N20和sgRNA scaffold序列）；以W24基因组分别扩增左、右修复模板，使用OverlapPCR将其连接得到683bp的Donor，再分别酶连至pUC19载体构建双靶点载体pUC-spacer-Donor；首先将pCas质粒电转化至W24，经L-(+)-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，再电转pUC-spacer-Donor质粒获得Hcp1全基因缺失株ΔHcp1，共缺失523bp（Hcp1编码区483bp及上游非编码区40bp）。
（2）E.coli Hcp1的致病性：将昆明小鼠分成4组：生理盐水组、LPS组、W24组和ΔHcp1组（n=15）。相对于对照组，各组小鼠精神萎靡，12h症状加重且体温达峰值，ΔHcp1组与W24组无明显差异。剖检小鼠发现实验组肠壁菲薄，各器官可见出血点。相对于对照组，肝脏指数增加（p<0.01），肝脏显著肿大，但肾脏差异不显著。生化分析发现W24组促进肝肾功能损伤，但在ΔHcp1组这种现象减轻，血清AST、ALT、CRE 和 BUN显著变化证明了这一点（p<0.01）。与对照组相比，H&E显示肝脏淤血，结构破坏严重，细胞损伤，炎性细胞侵润；而肾脏发生出血，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔内充满浆液，炎性细胞等；TEM发现肾小管上皮细胞损伤严重，细胞器被破坏；在肝细胞中观察到同样的现象，W24组小鼠较ΔHcp1组症状更为严重。IHC显示，缺失Hcp1后，IL-1β和IL-18在肝细胞和肾小管上皮细胞中较W24组表达显著降低（p<0.01）。提示Hcp1参与E.coli感染宿主的过程，具有毒力作用，增强E.coli的致病性，造成小鼠急性肝损伤（Acute Liver injury，ALI）和AKI。