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： 红嘴鸥γ干扰素的克隆、表达及其对Mx基因调控的研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 红嘴鸥γ干扰素的克隆、表达及其对Mx基因调控的研究/.任胜杰著/.常华指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.31 |
| 载体形态项： | 122页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210423 |
| 提要文摘： | 干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）具有较强的免疫调节功能，对淋巴细胞具有激活作用，提高抗体依赖的细胞毒反应，增强免疫细胞的免疫活性。目前，IFN-γ在禽类的研究主要是家禽，对于野生鸟类的研究较少，故本实验选择红嘴鸥为研究对象，扩增红嘴鸥IFN-γ基因CDS，体外探究红嘴鸥IFN-γ在免疫应答过程中对Ⅰ型干扰素激活通路中相关基因的调控和抗NDV作用。 1. 红嘴鸥IFN-γ基因克隆与生物信息学分析 以刀豆蛋白A刺激红嘴鸥淋巴细胞48 h后，提取RNA反转录后PCR扩增红嘴鸥IFN-γ基因，T克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示：PCR扩增获得与预期相符的片段，大小为498 bp。生物信息学软件分析结果表明红嘴鸥IFN-γ基因CDS共编码165个氨基酸，蛋白分子质量为19.16 ku，蛋白在第24-25位氨基酸处存在信号肽切割位点，有3个棕榈酰化位点，2个N-端糖基化位点，15个磷酸化位点；蛋白的二级结构以α-螺旋为主，进化树分析表明红嘴鸥与家鸽的进化关系较近。 2. 红嘴鸥IFN-γ基因原核表达及多克隆抗体的制备 构建红嘴鸥IFN-γ原核表达重组质粒pET32a-IFN-γ，将其转化至表达菌株后分别进行表达菌株、温度、诱导时间和IPTG浓度优化；将纯化的重组蛋白免疫兔子制备其多克隆抗体并进行抗体的效价和特异性鉴定。结果表明：重组蛋白在Transetta（DE3）中用0.6 mmol/L的IPTG在37 ℃下诱导5 h表达最好；重组蛋白大小约为35 ku并经过质谱鉴定；重组蛋白以包涵体的形式表达并经尿素洗涤和亲和层析后获得较纯的重组蛋白；重组蛋白在复性后用Bradford法测定其浓度为384.21 μg/mL；将重组蛋白免疫兔子后分离血清，使用双向琼脂扩散法检测血清效价为1∶4，间接ELISA法检测在包被20 μg抗原后的最佳血清价效为1∶2 000；血清抗体在经过饱和硫酸铵-正辛酸纯化后，经Western-blotting检测表明，制备的抗体具有良好的特异性。 3. 红嘴鸥IFN-γ基因在DF-1细胞中的转录与表达特征 构建红嘴鸥IFN-γ真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFN-γ，将其转染至DF-1细胞，并用RT-qPCR法与间接免疫荧光技术检测红嘴鸥IFN-γ基因的转录与表达特征。结果表明：该基因在转染后1 h可被检测出，转染后30 h内的转录水平逐渐增加，最高为9 110.58。间接免疫荧光检测发现在转染DF-1细胞后4 h后即可观察到绿色荧光，直至72 h时依然能检测到绿色荧光，通过核染色发现绿色荧光多分布在细胞质中。 4. 红嘴鸥IFN-γ重组蛋白与NDV孵育淋巴细胞后NDV NP和红嘴鸥TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ、Mx基因相对转录量的变化 （1）50 μg/mL、200 μg/mL、350 μg/mL的重组蛋白孵育红嘴鸥淋巴细胞后红嘴鸥TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ和Mx基因相对转录量的变化，荧光定量结果表明：三种剂量的重组蛋白均可随着时间的推移提高红嘴鸥淋巴细胞中TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ和Mx基因的转录水平（P<0.05），尤其36 h以后的各相关基因转录水平显著提升（P<0.01）。 （2）250 μL、500 μL、750 μL TCID50的NDV上清孵育红嘴鸥淋巴细胞后红嘴鸥TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ、Mx相对转录量的变化，荧光定量结果表明：三种剂量的NDV均可提高红嘴鸥淋巴细胞中TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ和Mx基因的转录水平（P<0.05），其中500 μL组的各相关基因的24 h-72 h转录水平极显著（P<0.01）。 （3）选择200 μg/mL的重组蛋白与500 μL TCID50的NDV上清共同孵育红嘴鸥淋巴细胞后检测NDV NP和红嘴鸥TLR7、MyD88、IFN-α、IFN-γ、Mx基因相对转录量的变化。结果表明：与病毒组相比NDV NP基因的转录水平明显下降（P<0.05），72 h的水平下降更加显著（P<0.01），TLR7、MyD88基因的转录水平下降（P<0.05），IFN-α、IFN-γ和Mx基因的转录水平提高（P<0.05）。 本研究表明红嘴鸥IFN-γ可通过激活与Ⅰ型干扰素通路中共同的干扰素刺激基因发挥抗NDV作用，为进一步研究红嘴鸥免疫系统功能提供重要参考。 |
| 并列题名： | Cloning and expression of interferon γ of Larus ridibundus and its regulation of Mx gene eng |
| 题名主题： | 干扰素γ 多克隆抗体 转录特征 表达特征 基因调控 学位论文 |
| 中图分类： | S858.93-533 |
| 个人名称等同： | 任胜杰 著 |
| 个人名称次要： | 常华 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240520 |