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： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ对C/EBPβ与PLIN1的调控及对脂解作用影响的研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 过氧化物酶体增殖物激活受体γ对C/EBPβ与PLIN1的调控及对脂解作用影响的研究/.张家翔著/.信吉阁指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.1 |
| 载体形态项： | 47页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210428 |
| 提要文摘： | 过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ）是脂肪代谢中的一个重要调控因子，且目前已有研究揭示CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBPβ）基因与围脂滴蛋白（Perilipin 1，PLIN1）基因参与脂肪代谢与PPARγ基因有关。但PPARγ与C/EBPβ和PLIN1基因之间的调控机制以及对脂解作用影响尚未完全阐明。猪小肠上皮细胞（Porcine intestinal epithelial cell line，IPEC-J2）是重要的消化吸收细胞，在脂肪的消化吸收过程以及免疫调控中都发挥着重要作用；小鼠单核巨噬细胞（Leukemia cells of mouse mononuclear macrophage，RAW264.7）在过量吞噬脂质的情况下，会发生脂质代谢障碍，且2种细胞都是被广泛应用的体外模型。本研究分别以猪小肠上皮细胞系与小鼠单核巨噬细胞系为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统构建PPARγ基因打靶载体、转染细胞、构建PPARγ基因敲除细胞，免疫荧光检测PPARγ蛋白表达，实时荧光定量RT-PCR（Real-time quantitative RT-PCR，qRT-PCR）技术检测C/EBPβ与PLIN1 mRNA表达变化，以此探究PPARγ基因与C/EBPβ和PLIN1基因之间的调控机制，以及在小鼠单核巨噬细胞上探究PPARγ基因敲除对脂解作用的影响，为进一步了解PPARγ基因对脂肪代谢的作用以及动物模型构建实验提供基础和依据。 1、PPARγ基因敲除对IPEC-J2细胞C/EBPβ与PLIN1基因表达的影响 以猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）为实验对象，根据猪PPARγ基因序列（GeneID:397671），在第2外显子区域设计2对sgRNA序列，经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1；将构建成功的打靶载体和Cas9-nickase质粒共转染至染猪IPEC-J2细胞，经G418药物筛选获得单克隆细胞株，对单克隆细胞株取样，提取DNA后进行PCR扩增，经凝胶电泳鉴定后送测序，挑选基因敲除效果最佳的细胞株，利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况，利用qRT-PCR检测C/EBPβ与PLIN1 mRNA相对表达量。打靶载体测序结果显示，sgRNA序列正确连接；转染、筛选后共获得48个单细胞克隆；PCR扩增后测序，48个细胞克隆均测序成功，其中有6个细胞克隆测序结果为双峰；免疫荧光检测结果显示基因敲除组PPARγ基因表达降低；qRT-PCR结果显示，PPARγ基因敲除组中基因PLIN1表达显著降低（P＜0.05），C/EBPβ基因表达量差异不显著（P＞0.05）。 2、PPARγ基因敲除对RAW264.7细胞C/EBPβ与PLIN1表达以及脂解作用的影响 以RAW264.7细胞为实验对象，根据小鼠的PPARγ基因序列（GeneID:19016），在第6外显子区域设计2对sgRNA序列，退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1；将构建成功的打靶载体和Cas9-nickase质粒共转染至染小鼠RAW264.7细胞，经G418药物筛选获得克隆细胞，对细胞克隆取样，提取DNA后进行PCR扩增，经凝胶电泳鉴定后送测序，确定测序结果为双峰后，利用免疫荧光检测PPARγ蛋白表达；ox-LDL诱导小鼠RAW264.7后，油红O染色观察脂滴数量等，利用qRT-PCR检测C/EBPβ与PLIN1 mRNA相对表达量，利用免疫荧光的方法检测激素敏感性甘油三酯脂肪酶蛋白（Hormone-sensitive lipase，HSL）的表达。打靶载体测序结果显示，sgRNA序列正确连接；经转染、G418药物筛选后得到细胞克隆；PCR扩增后测序峰图的结果显示为双峰；免疫荧光检测结果显示PPARγ基因表达降低；油红O染色结果显示，PPARγ基因敲除组中脂滴数量减少；qRT-PCR结果显示，PPARγ基因敲除组中基因PLIN1表达显著降低（P＜0.05），C/EBPβ基因表达量差异不显著（P＞0.05）；免疫荧光结果显示，PPARγ基因敲除组HSL蛋白表达量增多。 综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9系统构建PPARγ打靶载体，经转染、筛选获得了猪小肠上皮细胞与小鼠单核巨噬细胞的PPARγ基因敲除细胞，揭示了PPARγ基因表达降低导致PLIN1基因的表达量下降，细胞中脂滴的数量减少，HSL脂解酶的蛋白表达增加，PPARγ基因可能通过调控PLIN1基因促进脂解作用。 |
| 并列题名： | Effects of Peroxisome Proliferative Activated Receptor Gamma on the Regulation of C/EBPβ and PLIN1 and on Lipolysis eng |
| 题名主题： | CRISPR/Cas9 基因敲除 PPARγ 脂解作用 学位论文 |
| 中图分类： | S858.28-533 |
| 个人名称等同： | 张家翔 著 |
| 个人名称次要： | 信吉阁 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240520 |