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1. 建立乙型脑炎病毒和盖塔病毒标准品
       本研究采用NCBI核酸数据库GenBank检索，获得10株不同基因型的乙型脑炎病毒和12株不同基因型的盖塔病毒的基因序列，使用DNAStar软件进行序列分析比对。在保守区域选取乙型脑炎病毒非结构蛋白JEV-NSP1和盖塔病毒的非结构蛋白GETV-NSP1基因序列，分别构建pMD19-T-JEV-NSP1质粒和pMD19-T-GETV-NSP1质粒作为标准品。
2. 检测乙型脑炎病毒和盖塔病毒荧光定量PCR方法标准曲线的建立
       以pMD19-T-JEV-NSP1质粒和pMD19-T-GETV-NSP1质粒作为标准品，分别设计3对引物和3条特异的TaqMan探针，该方法在10⁸拷贝/μL到10¹拷贝/μL之间具有良好的线性关系。JEV和GETV的标准曲线方程分别为：y=-3.397x+41.473，相关系数为0.998，扩增效率为97.0%；y=-3.384x+41.000，相关系数为0.998，扩增效率为97.5%。
3. 乙型脑炎病毒和盖塔病毒荧光定量PCR方法条件优化
       乙型脑炎病毒和盖塔病毒荧光定量PCR方法通过特异性实验、敏感性实验、重复性实验、适用性实验、符合率实验、退火温度优化实验、引物探针添加量优化实验和反应程序优化实验，建立盖塔病毒和乙型脑炎病毒双重荧光TapMan定量RT-PCR方法。结果显示：最佳条件为JEV引物的最佳添加量为1μL（200 nmoL/L），JEV探针的最佳添加量为0.25μL（200 nmoL/L）；GETV引物的最佳添加量为1μL（200 nmoL/L），GETV探针的最佳添加量为0.75μL（200 nmoL/L），以逆转录50℃ 10min，1个循环；预变性95℃ 5min，1个循环；扩增反应95℃ 15S，最佳退火温度为52℃ 20S，45个循环，可成功扩增检测到乙型脑炎病毒和盖塔病毒。
       该方法特异性强，只能检测到GETV与JEV，不能与CSFV、ASFV、PRV、PCV2、PRRSV、PEDV等其他病毒发生交叉反应；灵敏度较高，可检测到GETV的最低检测限为10拷贝/µL，JEV的最低检测限为5拷贝/µL；重复性好，无论是批间还是批内实验，变异系数均小于1%。且该方法快速，可在1h20min内检测出JEV和GETV。在适用性与符合率实验结果均为100%。
       本研究首次报道采用Taqman探针法建立同时检测盖塔病毒和乙型脑炎病毒的双重荧光定量RT-PCR方法，该方法快速准确、灵敏度和特异性高。