书目详细信息
： PP2A在α-鹅膏毒肽诱导的小鼠肝细胞凋亡与自噬中的作用
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | PP2A在α-鹅膏毒肽诱导的小鼠肝细胞凋亡与自噬中的作用/.许慧著/.王生奎，顾小龙指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.30 |
| 载体形态项： | 58页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210421 |
| 提要文摘： | 蘑菇中毒在国内外繁发，常造成人和动物死亡，已经成为影响公众健康最突出的公共卫生问题。根据国家突发公共卫生事件信息管理系统报告资料显示，在我国90%以上的蘑菇中毒死亡病例是由含鹅膏毒肽的蘑菇导致的。α-鹅膏毒肽（α-AMA）是鹅膏毒肽中毒性和含量最高的毒素，也是致死性蘑菇中毒的主要成分，其靶器官是肝脏。有研究表明，细胞凋亡和细胞自噬在α-AMA致肝损伤过程中起到重要作用。凋亡与自噬不是互不干扰的细胞路径，二者间有着较为复杂的关系。越来越多的证据表明，自噬和凋亡能够协作，或者拮抗，从而影响细胞的命运。一般情况下，自噬是一种保护机制，使细胞免于死亡，但是当它的激活超过一定阈值后会使细胞功能崩溃，导致细胞死亡。目前，对于α-AMA中毒的治疗没有特效解毒剂，现采用的一些治疗方法或解毒药大都没有很好的临床疗效。因此，进一步解析α-AMA的毒理机制，寻找新的治疗靶点是当务之急。 PP2A是在真核细胞内一种高度保守且普遍存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。以往研究表明PP2A参与调控真核细胞内多个信号通路，在细胞周期调控、细胞凋亡、自噬等多个细胞生物学进程中起着重要作用，且有研究发现一种黑腹果蝇能够耐受α-AMA，全基因组关联分析后，认为PP2A在帮助果蝇抵制α-AMA方面有重要作用。 所以，本研究以小鼠肝细胞系AML-12细胞和昆明小鼠为研究对象，引入PP2A siRNA、PP2A抑制剂LB-100或PP2A激活剂FTY720，通过观察AML-12细胞活力，昆明小鼠肝损伤情况及抑制或增强PP2A后，α-AMA诱导AML-12细胞和小鼠肝细胞凋亡、自噬变化情况，从体内外水平探究PP2A在α-AMA诱导小鼠肝细胞凋亡和自噬中的作用，解析PP2A是否在哺乳动物的α-AMA中毒中也起到了类似的保护作用。 目的：本研究从体内外水平探讨PP2A在α-AMA诱导小鼠肝细胞凋亡和自噬中的作用，解析PP2A是否在哺乳动物α-AMA中毒中起到保护作用，为α-AMA的毒理机制研究及治疗靶点的发现提供理论依据。 方法：（1）选取小鼠肝细胞系AML-12细胞为研究对象，以不同浓度α-AMA（0.2、1、2、4、8、12、16、20µM）分别处理细胞6h，12h和24h后，CCK-8检测AML-12细胞活力。根据CCK-8检测结果，取2µM、5µM、10µM的α-AMA处理AML-12细胞24h建立细胞损伤实验，显微镜下观察AML-12细胞形态变化；Hoechst 33258染色检测α-AMA诱导AML-12细胞凋亡；Western blot检测凋亡与自噬相关蛋白表达水平变化，分析了解细胞自噬和细胞凋亡在α-AMA损伤过程中的作用。通过引入PP2A siRNA和PP2A抑制剂LB-100抑制PP2A后，通过CCK-8检测AML-12细胞活力变化，Western blot检测凋亡与自噬相关蛋白表达水平，分析了解PP2A在α-AMA诱导AML-12细胞凋亡和自噬中的作用。（2）选取42只42日龄体重相近（45±2g）的昆明小鼠分7组，每组6只，以1.5mg/kg•BW PP2A抑制剂LB-100或1.5mg/kg•BW PP2A激活剂FTY720腹腔注射小鼠3h后，再以0.33mg/kg•BW或0.53mg/kg•BW腹腔注射α-AMA处理小鼠36h，麻醉小鼠并称重，收集小鼠血液和肝脏，血清生化法检测小鼠肝脏指标AST、ALT的活力变化；HE染色观察小鼠肝脏组织病理变化；透射电镜观察小鼠肝细胞超微结构；荧光显微镜（TUNEL染色）观察小鼠肝细胞凋亡宏观变化，分析了解α-AMA对小鼠肝损伤情况及PP2A在α-AMA诱导小鼠肝细胞凋亡和自噬中的作用。 结果：（1）经CCK-8法检测发现，AML-12细胞活力逐渐下降（P<0.01），表明α-AMA对AML-12细胞活力具有抑制作用，且呈现浓度和时间依赖性。在α-AMA对AML-12细胞损伤的实验中，成功建立细胞模型；Hoechst 33258染色提示经α-AMA处理过的AML-12细胞发生凋亡；Western blot检测凋亡与自噬相关蛋白表达水平，结果显示，随α-AMA浓度增加，Bax/Bcl-2蛋白表达比例渐上升（P<0.01），Cleaved caspase-3表达水平逐渐上升（P<0.01），Cleaved PARPⅠ表达水平逐渐上升（P<0.01），LC3Ⅱ表达水平上升（P<0.01），P62表达水平下降（P<0.01），表明α-AMA能够诱导AML-12细胞发生线粒体依赖性凋亡和自噬，且呈浓度依赖性。用LB-100和PP2A siRNA预处理抑制PP2A后，与单独α-AMA处理组相比，CCK-8检测结果显示AML-12细胞活力进一步显著降低（P<0.05），Western blot检测结果显示Bax/Bcl-2蛋白表达水平进一步提高（P<0.01），Cleaved caspase-3蛋白表达水平进一步增加（P<0.01），Cleaved PARPⅠ表达水平进一步增加（P<0.01），LC3Ⅱ表达水平下降（P<0.01），P62表达水平上升（P<0.01）。表明抑制PP2A能够抑制AML-12细胞活力和α-AMA诱导的AML-12细胞自噬，促进α-AMA诱导的AML-12细胞线粒体依赖性凋亡。（2）体内实验结果显示，α-AMA组小鼠肝脏系数（P>0.05）、肝功能指标AST、ALT活力（P<0.05）；随α-AMA剂量增加而增加，α-AMA处理组的小鼠肝细胞经HE染色呈现出不同程度的病理变化：细胞坏死灶、细胞空泡变性等；经透射电镜观察到线粒体的结构遭到不同程度的破坏，出现线粒体嵴减少、模糊不清，线粒体基质密度变淡、不均匀，也可观察到自噬小体、溶酶体增加；经荧光显微镜观察到TUNEL阳性细胞增多。PP2A抑制剂LB-100抑制PP2A活性后，小鼠肝脏系数（P>0.05）、肝功能指标AST、ALT活力（P<0.01）进一步显著升高；进一步加剧小鼠肝脏病理损伤、肝细胞中线粒体损伤及TUNEL阳性细胞的产生。PP2A激活剂FTY720增强PP2A活性后，逆转这一趋势，HE染色发现α-AMA对小鼠肝细胞产生的病理损伤基本消失，细胞结构、排列方式与对照组无明显差别；超微结构显示小鼠肝细胞中自噬小体、溶酶体增加，线粒体异常结构减少，小鼠肝细胞中TUNEL阳性细胞减少。表明α-AMA能够诱导小鼠肝细胞凋亡和自噬，导致小鼠肝损伤，抑制PP2A活性能够加速肝细胞中线粒体损伤，促进小鼠肝细胞凋亡，加剧小鼠肝损伤，增强PP2A活性能够促进肝细胞自噬清除受损的线粒体，抑制小鼠肝细胞凋亡，缓解肝损伤。 结论：α-AMA可明显抑制小鼠AML-12细胞的活力，诱导小鼠肝细胞自噬，以及线粒体依赖性凋亡，导致小鼠肝损伤。抑制PP2A能够抑制α-AMA诱导的小鼠肝细胞自噬，促进α-AMA诱导的小鼠肝细胞线粒体依赖性凋亡，进一步抑制小鼠AML-12细胞活力，加速α-AMA对小鼠肝细胞的毒性损伤。而激活PP2A则逆转该作用。所以，PP2A可作为哺乳动物α-AMA中毒的一个新的治疗靶点。 |
| 并列题名： | Effects of PP2A on α-amanitin-induced apoptosis and autophagy in mouse hepatocytes |
| 题名主题： | α-AMA 肝脏 凋亡 自噬 PP2A 学位论文 |
| 中图分类： | S856.5-533 |
| 个人名称等同： | 许慧 著 |
| 个人名称次要： | 王生奎 指导 |
| 个人名称次要： | 顾小龙 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |