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： 咖啡豆水提物化学组成及其对骨细胞和骨代谢的作用机制研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 咖啡豆水提物化学组成及其对骨细胞和骨代谢的作用机制研究/.苗玥著/.龚加顺指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.5 |
| 载体形态项： | 137页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2019110005 |
| 提要文摘： | 咖啡隶属于茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea），是重要的多年生常绿经济作物。小粒咖啡是云南重要的特色产业，种植面积和产量占全国98%以上，也决定了中国咖啡在世界咖啡中的地位。咖啡作为世界三大饮料之一，其与可可、茶同为流行于世界的主要饮品。但多年来各国对咖啡豆成分组成、品质指标、品质评价以及长期饮用安全风险等问题研究报道极少。特别是咖啡对人体骨代谢健康还存在较大的争议，长期摄入咖啡或咖啡饮用量与骨代谢的关系还缺乏充足的科学实验依据，亟待深入研究。为进一步揭示饮用咖啡与骨代谢的关系，利用MC3T3-E1和RAW264.7细胞分别建立成骨细胞和破骨细胞分化模型，通过ALP染色及活性测定、TRAP染色及活性测定、细胞因子测定，评估咖啡水提物、咖啡因（对照）是否对成骨细胞和破骨细胞的分化和活性有抑制或者促进作用，明确作用机制。进而构建去卵巢骨质疏松小鼠模型，通过ELISA实验确定咖啡水提物、咖啡因对血清骨吸收指标的影响。利用μCT、HE染色、TRAP染色考察咖啡水提物、咖啡因对去卵巢小鼠骨质疏松模型的骨量作用、抗骨质疏松活性以及对体内破骨分化的抑制作用。取得主要研究成果如下： 1. 明确了中国主产区咖啡生豆品质特征成分差异。通过比较分析56个咖啡生豆样品，发现海南地区的罗布斯塔中粒种咖啡生豆中咖啡因和绿原酸含量显著高于云南省卡蒂姆小粒种咖啡生豆（P<0.05）；云南省不同产地小粒种咖啡生豆，保山地区样品总多酚含量、黄酮含量高，综合评分好。 2. UHPLC-QE-MS代谢组学分析结果发现，（1）通过比较卡蒂姆、铁皮卡、阿拉比卡3个小粒种代谢物指标，筛选出3-羟基香豆素、奎尼酸、异绿原酸、隐绿原酸、花生酸、L-苹果酸、海藻糖、L-谷氨酸等15个共有差异代谢物，说明卡蒂姆、铁皮卡和阿拉比卡存在亲缘关系。（2）五大洲咖啡生豆对比发现，亚洲地区咖啡生豆中，绿原酸、异绿原酸、3-羟基香豆素、亚油酰胺、棕榈酰胺、L-谷氨酸、D-天冬氨酸和L-苯丙氨酸的相对含量显著高于其他地区（P<0.05）。大洋洲咖啡生豆中的隐绿原酸，花生酸相对含量显著高于其他地区（P<0.05）。北美洲咖啡生豆中的丙氨酸相对含量显著高于其他地区（P<0.05）。琥珀酸，L-苹果酸的相对含量在北美洲和南美洲均较高。（3）将云南小粒咖啡生豆与其他地区咖啡生豆对比分析发现，云南小粒咖啡生豆中的3-羟基香豆素、4,5-二-咖啡酰奎宁酸、亚油酰胺、棕榈酰胺、蜜二糖、L-谷氨酸的相对含量显著高于其他地区（P<0.05）。（4）对云南不同地区咖啡生豆代谢物对比分析得到44种差异代谢物，其中有14种氨基酸类、11种脂质类、10种酚类、3种有机酸类以及糖类、萜类、醇类、其他类物质。结果表明云南小粒咖啡受环境、气候、海拔等因素影响，酚类、萜类、氨基酸、生物碱类较为丰富。 3. 冷萃咖啡水提物的最佳提取工艺为：超声处理时间30 min，料液比1:12 g/mL，提取次数2次，在此条件下提取率达到20.78%。热萃咖啡水提物的最佳提取工艺为：超声处理时间30 min，料液比1:12 g/mL，萃取温度80℃，在此条件下提取率达到19.98%。 4. 深度烘焙咖啡豆的热萃水提物总糖含量最高；浅度烘焙热萃、中度烘焙热萃咖啡水提物还原糖含量最高；浅度烘焙热萃咖啡水提物多酚含量最高；中度烘焙热萃咖啡水提物黄酮含量最高；烘焙程度及萃取方式对咖啡因含量影响不显著；随着烘焙程度的加深，绿原酸、葫芦巴碱含量降低；同一烘焙程度不同萃取方式对葫芦巴碱含量影响不显著；浅度烘焙热萃咖啡水提物DPPH自由基清除能力以及FRAP还原能力最佳；中度烘焙热萃咖啡水提物抗氧化能力（TEAC）最佳。相关性分析发现DPPH自由基清除能力与总酚含量相关；FRAP还原力与总酚、黄酮、绿原酸含量相关。 5. MC3T3-E1成骨细胞实验发现：（1）不同烘焙及萃取条件咖啡水提物、咖啡因在浓度≤50 μg/mL时对细胞存活率无影响，但能提高成骨细胞的ALP活力，促进成骨细胞增殖分化。矿化实验发现仅浅度/中度烘焙热萃咖啡对于成骨细胞钙结生成具有显著的促进作用（P<0.05），其中50 μg/mL咖啡因显著降低了钙结节的形成（P<0.05），存在健康安全风险。（2）成骨细胞生长与分化过程中细胞因子的变化结果显示，不同烘焙及萃取条件咖啡水提物对IL-6、IL-1β细胞因子有抑制作用；浅度烘焙热萃/冷萃咖啡水提物和中度烘焙热萃咖啡水提物对TNF-ɑ细胞因子有抑制作用，对COLⅠ细胞因子的分泌有促进作用；12.5 μg/mL咖啡因对IL-1β、TNF-ɑ细胞因子有抑制作用，但50 μg/mL咖啡因会促进IL-6、IL-1β细胞因子的释放，且抑制了COLⅠ细胞因子的分泌。（3）成骨相关标志基因表达发现，不同烘焙及萃取条件咖啡水提物以及12.5 μg/mL咖啡因促进了Runx2、Osterix、ALP、COL-1 mRNA的表达；50 μg/mL咖啡因会抑制Runx2、Osterix、ALP、COL-1 mRNA的表达。 6. 通过Western blot探究咖啡水提物及咖啡因对成骨细胞的影响发现，咖啡水提物通过抑制AKT、IκBɑ、P65、ERK的磷酸化，促进COL1A1、Runx2和Osterix的蛋白表达；12.5 μg/mL咖啡因抑制AKT、IκBɑ、P65、ERK、JNK和P38的磷酸化，促进了Runx2和Osterix的蛋白表达；但50 μg/mL咖啡因促进AKT、IκBɑ、P65、JNK的磷酸化，抑制Runx2和Osterix的蛋白表达，降低成骨作用。 7. RANKL诱导的RAW264.7破骨细胞实验发现：（1）不同烘焙及萃取条件咖啡水提物、咖啡因在浓度≤50 μg/mL时对细胞存活率无影响，但能降低破骨细胞的TRAP活力，抑制破骨细胞增殖分化；然而50 μg/mL咖啡因使多核细胞数量增加，促进破骨细胞增殖。（2）破骨细胞生长与分化细胞因子结果显示，不同烘焙及萃取条件咖啡水提物对IL-6、IL-1β、TNF-ɑ有抑制作用；12.5 μg/mL咖啡因对IL-1β、TNF-ɑ有抑制作用；50 μg/mL咖啡因促进IL-6、TNF-ɑ释放。（3）破骨相关基因标志物表达发现，不同烘焙及萃取条件咖啡水提物以及12.5 μg/mL咖啡因抑制了RANKL、TRAP、CTSK、c-FOS、NFATc1 mRNA的表达；50 μg/mL咖啡因结果与之相反。 8. 通过Western blot探究咖啡水提物及咖啡因对破骨细胞作用的影响发现，咖啡水提物通过抑制AKT、JNK、ERK、P38、IκBɑ、P65的磷酸化，抑制TRAP、CTR、CTSK、MMP9、RANKL、c-FOS、NFATc1的蛋白表达；12.5 μg/mL咖啡因通过抑制AKT、ERK、JNK、IκBɑ、P65的磷酸化，抑制了TRAP、CTR和CTSK的蛋白表达；但50 μg/mL咖啡因会促进P38、P65、JNK的磷酸化，促进CTR、CTSK、TRAP、RANKL的蛋白表达。 9. 咖啡因及咖啡水提物对去卵巢小鼠的生长发育、脏器健康无不良影响。55.44 mg/kg咖啡因及1.16 g/kg咖啡水提物可以有效改善左股骨/右股骨指数、E2水平、ACP/ALP值，提高OCN含量、Ca含量、P含量，对于维持骨稳态有一定的缓解作用。但更高剂量的咖啡因（110.88 mg/kg）以及咖啡水提物（2.32 g/kg）则会导致钙含量的流失。μCT、HE染色以及TRAP染色发现，55.44 mg/kg咖啡因、1.16 g/kg咖啡水提物对去卵巢骨质疏松小鼠模型的骨量丢失起到明显的保护作用（如：Tb.area、BMD、BV/TV、BS/TV、Tb.N显著增加），能抑制去卵巢小鼠体内的破骨细胞分化。相反更高剂量的咖啡因以及咖啡水提物会刺激去卵巢骨质疏松小鼠模型的骨量丢失，促进破骨细胞分化。 10. 假手术组与模型组相比筛选出49种小鼠血清差异代谢物，主要为脂肪酸类、氨基酸类以及生物碱类；阳性对照组与模型组相比筛选出39种小鼠血清差异代谢物，主要为脂肪酸类、氨基酸类以及酚类；咖啡水提物对小鼠血清的主要差异代谢物为脂质类、氨基酸类、生物碱类、核苷酸类、糖类；咖啡因对小鼠血清的主要差异代谢物为脂质类、氨基酸类、有机化合物类、激素类、生物碱类。去卵巢小鼠骨质疏松发病机制与机体磷脂代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢紊乱密切相关。其中主要影响的通路为鞘磷脂代谢、泛酸和CoA的生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、赖氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢。 本研究明确了中国主产区咖啡生豆品质特征及其差异成分，云南小粒咖啡的主要优势成分为酚类、萜类、氨基酸、生物碱类。咖啡水提物及咖啡因（每天饮用200 mL咖啡不超过4-5杯以及咖啡因摄入量不超过400 mg）在体内外均具有抑制破骨分化及功能的作用，在体内能明显减缓去卵巢导致的骨量丢失。其分子机制是通过干扰关键信号通路NF-κB、MAPK、AKT的激活，阻断体内转录因子NFATc1、c-FOS的入核，从而抑制成熟破骨细胞标志性基因（MMP9、Cathepsin K、CTR、TRAP）的表达来实现。同样地，咖啡水提物及咖啡因通过抑制关键信号通路NF-κB、MAPK、AKT的激活，促进成熟成骨细胞标志性基因（Runx2、COL1A1、Osterix）的表达，来实现成骨细胞的增殖分化及钙结形成。 |
| 并列题名： | Study on the chemical composition of coffee-water extract and its mechanism of action on bone cells and bone metabolism eng |
| 题名主题： | 咖啡 咖啡因 代谢组学 成骨细胞活性 破骨细胞活性 骨质疏松 学位论文 |
| 中图分类： | R459.9-533 |
| 个人名称等同： | 苗玥 著 |
| 个人名称次要： | 龚加顺 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |