书目详细信息
： 达玛烷型人参皂苷的糖基转移酶功能表征与生物合成
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 达玛烷型人参皂苷的糖基转移酶功能表征与生物合成/.林源著/.杨清辉, 杨生超指导 |
| 出版发行项： | 2023.1.3 |
| 载体形态项： | 144页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2018110010 |
| 提要文摘： | 人参属（Panax）植物是五加科（Araliaceae）重要的药用植物，大约有18个种。全属植物均可作药用，药用价值较高。而人参皂苷被认为是人参属植物发挥药用价值的关键因素。三七是较具代表性的一类人参属植物，其用药部位主要为根、芦头、叶和花，富含达玛烷型人参皂苷。三七现已鉴定出200多种皂苷，虽然部分合成人参皂苷的关键糖基转移酶（UGT）已被报道，但一些稀有皂苷，特别是具有木糖基团的稀有皂苷，催化其生成的UGT尚不明确，以及其UGT在三七不同时空中对人参皂苷合成发挥的作用仍然未能完全解析。这些稀有人参皂苷在植物中含量均少于0.1%，提取成本较高，同时也限制了其药理活性的研究，利用酿酒酵母工程菌生产稀有人参皂苷具有广泛的应用前景。 本研究以三七为代表性材料，挖掘和验证合成人参皂苷的木糖糖基转移酶；同时分析探究已知功能的 UGT 在三七不同年限和部位分布模式；并以酿酒酵母 ZW04BY 为起始菌株，构建产原人参二醇（PPD），G-Rh2，G-Rg3，G-Rd 等人参皂苷菌株；最后，将在研究中收集到的各组学信息整合分类，建立一个高度整合人参属多方向研究成果的综合性数据库——PanaxGDB，以友好简便的应用界面帮助从事人参属植物栽培驯化和重要皂苷生物合成的学者们更为迅速有效的获得最新相关信息。主要研究结果如下： 1. 本研究发现参与合成皂苷骨架的上游基因主要在芦头或须根中高表达，少数在花中大量表达；参与皂苷骨架糖基化修饰相关的UGT基因主要在芦头和须根中表达。进一步对已知功能UGT序列分析，推测motif 9和motif 6可能具有区分UGT催化底物是四环三萜还是五环三萜类化合物的关键位点，而PSPG保守区域的motif 4的氨基酸序列可能具有区别不同糖供体催化功能的位点之一。催化人参皂苷的UGT具有较相似的氨基酸排列特征，根据这些特征在UGT74、94、71亚家族中筛选出19个候选UGT，根据已知功能UGT在地下部分高表达的特征和序列motif特征，缩小至10条候选UGT。 2. qPCR结果的相关性分析表明，催化达玛烷型皂苷的部分UGT之间，或和CYP之间的基因表达水平保持一定的正相关；虽然Pno06G008735.t1和其同源序列PnGT95、Pn2-29的基因表达相关性较高（0.57-0.69），但它们间的表达水平差异较大，推测Pno06G008735.t1与Pn3-29、PnGT95具有不同转录方式。总的来说，不同年限的三七中，Pn3-32-i5的相对表达水平最低，Pn1-31表现出基因相对表达水平最高。 3. 10条候选UGT通过大肠杆菌或酿酒酵母获得可溶性蛋白，以11种达玛烷型人参皂苷为底物，最终发现PnUGT31和PnUGT53即能以UDP-木糖，也能以UDP-葡萄糖为糖供体，催化一系列达玛烷型人参皂苷。进一步证实了PnUGT31和PnUGT53都为催化C20-OH和连双糖功能的UGT，但PnUGT53更偏向于优先在C20位羟基加糖，PnUGT31更偏向于先加第二个糖。PnUGT31和Pn3-31是同一条功能酶。本研究均发掘了PnUGT31和PnUGT53的新功能，其中越南人参皂苷R18的合成途径首次被解析。 4. 以产PPD的酵母ZW04BY底盘细胞为基础，增加合成PPD的代谢流，使工程菌株LPPDS原人参二醇的产量达到1722.10±80.72 mg/L，但菌株LPPDS生长会受到明显抑制。为了比较PnUGT31和PnUGT53在酿酒酵母合成达玛烷型皂苷的能力，同时增加UDP-葡萄糖的储备，并去除β-葡萄糖苷酶（EGH1）对人参皂苷消耗的影响，构建EGH31和EGH53菌株。菌株EGH31产生0.95±0.08 g/ L的PPD，52.48±21.02 mg/ L的G-Rg3；菌株EGH53产生了1.03±0.06 g/ L的PPD，20.48±0.20 mg/ L的G-CK和4.40±0.13 mg/ L的G-Rh2。 5. 为了提高前体物质G-Rh2的存量，构建了LKG工程菌。与菌株EGH53相比，菌株LKG53的G-Rh2的产量由4.40±0.13 mg/ L增加至35.42±5.37 mg/ L；菌株LKG31的G-Rg3的产量（254.07±56.49 mg/ L）比菌株EGH31（52.48±21.02 mg/ L）的产量增加了3.84倍。其中菌株LKG31的G-Rg3的产量是目前已知报道中最高产量。 6. 构建了LKG31RS和LKG53RS菌株以提高DM对PPD的转化率，菌株LKG31RS产生了795.41±83.54 mg/L的PPD、0.72±0.14 mg/L的G-Rh2、164.58±24.54 mg/L的G-Rg3、26.21±12.86 mg/L的G-Rd；菌株LKG53RS产生了908.46±64.58 mg/L的PPD、54.57±6.36 mg/L的G-Rh2。综合比较，PnUGT31比PnUGT53更适合在酿酒酵母中生产二醇型人参皂苷，通过将以上模块叠加，菌株LKG53EGHLPPDS摇瓶发酵96h后可生产56.68±16.21 mg/L的G-Rd。其中菌株LKG53EGHLPPDS的G-Rd的摇瓶产量是已报道的相关研究中的最高产量。 7.通过MySQL、ThinkpHP和FastAdmin构建的人参综合信息数据库（http://panaxGDB.ynau.edu.cn）。该数据库集成了人参属种质资源信息、植物化学和多种组学数据形成一个便于检索的可视化界面，用于主要品种的比较研究、药理价值开发和皂苷的异质生物合成研究。该数据库分为5大主题，分别是种质资源，遗传信息，代谢物，群体结构，组学数据的采集和上传。 8. PanaxGDB的种质模块包含16个物种信息和62个品种信息。遗传信息模块通过直观的使用界面方便帮助使用者快速获得基因注释和在不同处理组合或组织中的表达水平等信息，另提供JBrowse和Blast工具以帮助用户使用人参属基因组组学数据，该模块包含了人参属植物的2个基因组和185个转录组。代谢物模块挖掘和分析了12个人参物种587种化合物，获取人参属皂苷核心代谢通路20多条，并提供快速检索化合物信息的友好型界面。群体结构上传了三七重测序的数据统计和SNP结果，并对与三七产量相关的农艺性状进行全基因组关联分析。组学数据的采集和上传模块对所有公开的数据进行了收集和分类并开放上传通道，在该数据库收集的组学数据包括405个转录组测序，2个基因组，21个宏基因组，67个叶绿体基因组，数据信息的直观性便于用户理解所获得的知识。 以上研究由点及面对人参皂苷合成途径及其关键酶功能的研究，探索三七中人参皂苷合成的分子机理，并建立人参皂苷异源合成系统以生产人参皂苷，最后组建一个人参属数据库为今后的人参属中的皂苷合成等研究提供线索。 |
| 并列题名： | Functional characterization of glycosyltransferase and heterologous biosynthesis of dammarane-type ginsenosides eng |
| 题名主题： | 三七 人参皂苷 糖基转移酶 生物合成 人参属植物 学位论文 |
| 中图分类： | S567.236-533 |
| 个人名称等同： | 林源 著 |
| 个人名称次要： | 杨清辉 指导 |
| 个人名称次要： | 杨生超 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |