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： 槟榔江水牛乳清蛋白源活性肽筛选、体外抗炎机制及稳态化研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 槟榔江水牛乳清蛋白源活性肽筛选、体外抗炎机制及稳态化研究/.赵琼著/.黄艾祥指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.20 |
| 载体形态项： | 104页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2020110006 |
| 提要文摘： | 随着我国高血脂、高血糖、高血压、高尿酸等慢性病人群增加，国家相继提出“健康中国2030”和“大健康产业”等战略，个性化功能因子的需求也越来越大。云南省作为特色动植物及微生物资源大省，具有挖掘个性化功能因子得天独厚的优势。且云南省水牛乳产业位居全国第二，以槟榔江水牛为特色代表，该水牛产奶量高、乳蛋白丰富，是挖掘功能因子尤其功能活性肽的优势资源。但由于其产品单一、缺乏高端特色产品、功能因子挖掘不够充分，导致槟榔江水牛乳产业发展受阻，资源优势难以转变为经济优势。食用乳清蛋白水解物具有提高免疫力、降血糖、降血脂等生物功能，而这些慢性疾病的发生往往伴随着炎症反应，槟榔江水牛乳清蛋白源活性肽是否也能发挥抗炎活性并通过抑制炎症反应进而发挥上述功能却未见报道。因此，本研究基于多组学技术靶向高效地从槟榔江水牛乳清蛋白水解液中挖掘抗炎活性肽并揭示其体外抗炎机理，针对抗炎肽胃肠环境抗性及生物利用率低等问题对其进行稳态化研究，最终在DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎体内进行稳态化后抗炎肽的效果初探。研究为实现食源性功能因子的体内靶向递送，进而实现人体精准营养干预和调节奠定基础。主要研究结果如下： 1. 联合多组学技术从槟榔江水牛乳清蛋白水解物中高效地筛选出2条新型抗炎肽（DQPFFHYN和YSPFSSFPR），其体外活性及安全性较高，但对胃肠环境抗性较弱。 （1）基于Label free蛋白组学分析水牛乳清蛋白功能活性。利用label-free定量蛋白组学从营养、免疫和抗炎等方面对水牛乳清蛋白进行分析，发现槟榔江水牛乳清蛋白中与免疫抗炎相关蛋白数量高于德宏水牛。进一步通过RAW264.7小鼠巨噬细胞评价其抗炎效果发现槟榔江水牛乳清蛋白也优于德宏水牛，因此选择槟榔江水牛乳清蛋白作为进一步筛选抗炎活性肽的原料。（2）基于多肽组学从槟榔江水牛乳清水解液中筛选出2条新型抗炎肽。Procerain B蛋白酶水解槟榔江水牛乳清蛋白后经超滤获得小分子肽段，利用LC-MS/MS技术从中共鉴定到1483条肽段，联合生物信息学分析从1483条肽段中筛选出12条目标肽段进行化学合成，再利用细胞炎症模型从中筛选出2条抗炎肽（DQPFFHYN和YSPFSSFPR），均为首次报道，命名为DN8和YR9。（3）抗炎肽DN8和YR9结构及性质表征。DN8包含8个氨基酸，位于α-2-glycoprotein-1蛋白（A0A452DK44）的52~59位氨基酸，分子量为1067.458 Da，疏水性为11.5 kcal/mol；YR9包含9个氨基酸，位于Clusterin蛋白（P17697）的200~208位氨基酸，分子量为1087.52 Da，疏水性为7.24 kcal/mol。经体外安全性及稳定性评价发现肽DN8和YR9体外安全性较高，但对胃环境抗性较弱。经计算机模拟胃肠道消化分析发现肽DN8和YR9易被胃肠道酶降解为单个氨基酸或短肽，且这些肽段均未显示抗炎活性。 2.乳清蛋白源抗炎肽DN8和YR9通过介导TLR2/NF-κB信号通路来缓解LPS诱导的RAW264.7细胞炎症。 （1）抗炎肽DN8和YR9能显著抑制炎症细胞分泌促炎因子NO、TNF-α和IL-6。利用ELISA检测发现在200 µg/mL浓度下，抗炎肽DN8对TNF-α和IL-6的抑制率分别为50.10%和60.44%；YR9对TNF-α和IL-6的抑制率分别为62.91%和44.34%。其抗炎机制可能与抑制炎症因子分泌有关。（2）基于TMT蛋白组学预测抗炎肽DN8和YR9通过调节TLR2/NF-κB通路来缓解细胞炎症。通过TMT蛋白组学从抗炎肽DN8组与LPS模型组比共发现194个显著差异蛋白，其中14个与炎症相关。从抗炎肽YR9组与LPS模型组中发现167个差异蛋白，14个与炎症相关。经GO注释及KEGG通路富集分析发现这些与炎症相关的蛋白主要参与Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路。进一步分析这两条通路上关键蛋白发现TLR2、MyD88、IKBb1、IKBa、p50、NOS2、COX2蛋白在抗炎肽处理组细胞中的表达显著下降。提示抗炎肽DN8和YR9可能通过介导TLR2/NF-κBp50信号通路减轻LPS诱导后RAW264.7细胞的炎症损伤。（3）Western blot验证发现抗炎肽DN8和YR9通过调节TLR2/NF-κB信号通路缓解细胞炎症损伤。WB进一步验证发现抗炎肽DN8和YR9能显著下调LPS诱导后RAW264.7细胞表面受体蛋白TLR2、下游蛋白MyD88、pIKBα、pNF-κBp50及调控促炎因子蛋白iNOS、TNF-α、IL-6表达水平。该结果与TMT蛋白组学结果一致，说明抗炎肽DN8和YR9主要通过调控TLR2/NF-κBp50信号通路减轻LPS诱导后RAW264.7细胞的炎症损伤。 3．成功构建了负载抗炎肽DN8和YR9的纳米包合物CM-β-CD-DN8、CM-β-CD-YR9，其主要通过静电吸附作用和共价键交联包合，具有较好活性、稳定性及靶向性。 （1）纳米包合物CM-β-CD-DN8和CM-β-CD-YR9具有较好的包封率及抗炎活性。通过细胞毒性评价发现CM-β-CD对细胞无毒性且能促进增殖。利用UV-Vis光谱检测发现在CM-β-CD：抗炎肽为10：5时包合效果最佳，通过FITC标记肽检测出CM-β-CD-DN8和CM-β-CD-YR9包封率分别为82.513±4.617，90.974±0.421。纳米包合物对RAW264.7细胞无毒性，且能显著降低LPS诱导后RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-6水平。（2）壁材CM-β-CD主要通过静电吸附作用和共价键交联与抗炎肽DN8和YR9成功包合。CM-β-CD-DN8和CM-β-CD-YR9包合物表面带弱负电荷，分别为-26.767±2.250、-12.137±3.048，平均粒径分别为75.03 nm、41.71 nm。通过FTIR和分子对接技术对包合物结构和键能表征发现CM-β-CD-DN8、CM-β-CD-YR9通过共价键交联相结合。表明纳米包合物CM-β-CD-DN8和CM-β-CD-YR9主要通过静电吸附作用和共价键交联进行包合。（3）CM-β-CD载体提高了抗炎肽DN8和YR9的稳定性及肠道靶向释放性。CM-β-CD-DN8和CM-β-CD-YR9具有良好的体外安全性、热稳定性及胃蛋白酶抗性，在模拟胃环境中的释放得到了控制，而在肠环境中得到了释放。 4．体内抗炎效果初探发现稳态化后抗炎肽有效缓解了DSS诱导的C57BL/6J小鼠溃疡性结肠炎症状。 稳态化抗炎肽DN8和YR9能有效缓解溃疡性结肠炎小鼠死亡率、体重下降情况、疾病指数、结肠长度、肝脏和脾脏肿大等症状。结肠H&E染色、免疫组化和免疫荧光切片发现经抗炎肽DN8和YR9干预后小鼠结肠杯状细胞数量明显增多，排列紧密有序，固有层和黏膜下层炎细胞浸润情况也大幅改善。同时，增加了影响结肠通透性的主要蛋白ZO-1和Occludin表达，改善了溃疡性结肠炎小鼠肠屏障功能。 |
| 并列题名： | Screening of whey protein-derived active peptides from Binglangjiang buffalo, in vitro anti-inflammatory mechanism and stabilization eng |
| 题名主题： | 水牛乳清蛋白 抗炎肽 TLR2/NF-κB通路 稳态化 纳米颗粒 溃疡性结肠炎 蛋白组学 学位论文 |
| 中图分类： | TS201.4-533 |
| 个人名称等同： | 赵琼 著 |
| 个人名称次要： | 黄艾祥 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |