书目详细信息
： 鞣花酸通过增加LDLR改善动脉粥样硬化的作用及机制研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 鞣花酸通过增加LDLR改善动脉粥样硬化的作用及机制研究/.王立甜著/.盛军指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.31 |
| 载体形态项： | 87页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2020110002 |
| 提要文摘： | 动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVDs）是世界范围内的一个重大健康问题。动脉粥样硬化（AS）是由胆固醇等物质沉积在动脉内壁引起的慢性血管疾病，其特点是患病率高、致残率高、病死率高。高水平的血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是AS发生和发展的关键危险因素，细胞膜表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）对于清除血浆中LDL-C是至关重要的。前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是一种肝细胞合成的丝氨酸蛋白酶，在血液中循环可与LDLR结合，促进LDLR降解。临床上采用的PCSK9单抗是通过阻断PCSK9与LDLR的结合，抑制LDLR的降解，进而提升细胞表面LDLR的表达来降低血液中胆固醇水平，这种效果良好。我们试图从天然化合物中找到能够防治AS的活性成分，石榴、树莓和茶叶等中含有的鞣花酸（EA）可以减少脂肪细胞的生成，预防内皮细胞炎症，抑制血管平滑肌细胞增殖等，我们以EA为研究对象，研究其降低胆固醇改善AS的作用及其分子机制。主要研究结果如下： 1. EA通过抑制PCSK9的分泌和增加LDLR基因表达来提升LDLR蛋白水平。（1）利用人肝癌细胞（HepG2细胞）进行体外实验模型来探究EA对LDLR调节的作用。通过Western Blot实验探究EA对LDLR蛋白表达的影响，结果显示20 μM的EA处理HepG2细胞24h可以使LDLR蛋白水平提升约76%。（2）通过RT-qPCR实验对EA处理的HepG2细胞中LDLR mRNA表达进行检测，结果显示EA将LDLR mRNA的半衰期从约1.5h增加到约2.3h，延长LDLR mRNA的半衰期，增强LDLR mRNA的稳定性。（3）激活EGFR信号通路可以促进LDLR表达，结果显示EA能够激活EGFR-ERK1/2信号通路。为了进一步确定EA对LDLR的促进作用与EGFR-ERK1/2信号通路的激活有关，使用EGFR单抗西妥昔封闭EGFR信号通路，发现EA对EGFR-ERK1/2信号通路的激活作用可以被EGFR单抗西妥昔阻断，同时EA诱导的LDLR蛋白水平增加也被EGFR单抗西妥昔抑制。（4）通过分子互作和分子对接模拟技术检测EA与EGFR的相互作用情况，结果显示EA与EGFR胞外段结合，KD值为4.33×10-7 M。分子对接结果显示，EA和EGFR之间的结合能为-7.1 kcal/mol，其中氢键和疏水相互作用是两者结合的主要方式，使EA能够稳定地结合到EGFR蛋白“口袋”位置。（5）PCSK9会导致LDLR蛋白降解，对EA处理后的HepG2细胞培养液中PCKS9含量进行检测。ELISA实验结果显示EA能够减少HepG2细胞培养液中PCSK9的含量。（6）RT-PCR实验结果显示EA能够降低PCSK9 mRNA水平（33%）。（7）HNF1α和FoxO3参与PCSK9基因的调控，通过Western Blot实验对HepG2细胞中FoxO3和HNF1α蛋白表达进行检测，结果显示EA促进FoxO3蛋白表达，抑制HNF1α的蛋白表达。以上结果表明EA通过两种途径增加LDLR的蛋白水平。其一：EA可能结合在EGFR的胞外段来激活EGFR-ERK1/2信号通路，进而增加LDLR mRNA表达；其二：EA通过增加FoxO3和降低HNF1α的表达，从而减少PCSK9的分泌，进一步抑制LDLR的降解。 2. 人血清白蛋白（HSA）负载EA纳米颗粒（EA naps）增加LDLR蛋白表达。EA在水中的溶解度较差（小于10 μg/mL），生物利用度低，因此本研究以HSA作为药物载体，采用自组装法制备负载EA的HSA纳米颗粒（EA naps），并在HepG2细胞上探究EA naps对LDLR的影响。（1）EA和HSA的比例（w/w）为0.1时，载药率（LC）为7.99%。EA naps平均粒径在205.5nm，很适合在体内传递，且其Zeta电位值为-26.1 mV，配方的稳定性高，适合静脉注射。同时，EA naps的体外释放结果表明，包封后的药物具有缓释作用，为延长药物在体内的循环提供一种有效的途径。（2）本研究通过Western Blot和RT-qPCR实验对EA naps在HepG2细胞中LDLR的表达进行检测，结果表明EA naps能够激活EGFR信号通路，进而增加LDLR mRNA和蛋白表达。（3）通过ELISA、RT-PCR和Western Blot实验对HepG2细胞中PCSK9的含量进行检测，结果表明，EA naps通过增加FoxO3和降低HNF1α的表达，减少HepG2细胞培养液中PCSK9的含量和PCSK9 mRNA水平。上述结果表明HSA是一种良好的药物载体，EA naps通过与EA相同的途径增加LDLR的蛋白表达，并且EA浓度为20 μM的EA naps和EA的效果相当。上述实验结果为在动物模型中验证EA改善AS的作用及分子机制奠定理论基础。 3. EA抑制ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化斑块的形成，改善AS的发生。采用ApoE-/-小鼠模型用作AS研究模型，本研究选用高胆固醇饮食喂养小鼠，连续12周注射给予EA naps（EA剂量为20mg/kg），探究EA在体内增加LDLR的表达来减少LDL-C改善AS的作用。（1）通过对小鼠血清中的TC和LDL-C水平进行检测，结果显示，EA可显著降低高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中TC和LDL-C的水平。（2）肝脏在调节胆固醇代谢平衡上起着关键的作用，也是血浆胆固醇的主要来源。通过比较肝脏外观、油红O染色和H&E染色，发现EA可以改善高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中肝脏脂质堆积。这些结果提示EA在体内可能具有改善AS的效果。（3）大体主动脉和主动脉根部油红O染色结果显示，EA显著减少高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中大体主动脉斑块和主动脉窦斑块的产生以及主动脉根部富含脂质区域。（4）巨噬细胞的浸润促使AS的发生发展，巨噬细胞标志物CD68免疫荧光染色结果显示，EA可显著降低高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中主动脉根部CD68的含量。（5）VSMCs是构成血管壁组织结构和维持血管张力的主要细胞。αSMA（VSMCs的标记物）免疫荧光染色结果显示，EA可显著增加高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中主动脉根部VSMCs的含量。（6）EVG染色用于AS变薄和缺失的弹性纤维的鉴别，EVG染色分析显示，EA可显著增加高胆固醇饮食诱导的ApoE-/-小鼠中主动脉根部弹性纤维的含量。（7）Western Blot实验和RT-qPCR实验结果显示，EA可以显著提高ApoE-/-小鼠肝脏中LDLR mRNA和蛋白水平，以及提高EGFR和ERK磷酸化水平。（8）通过Western Blot、ELISA和RT-qPCR实验结果显示，EA减少ApoE-/-小鼠血清中PCSK9的含量，抑制肝脏中PCSK9的表达。EA增加ApoE-/-小鼠肝脏中FoxO3的蛋白表达和降低HNF1α的蛋白表达，其体内效应与体外观察结果一致。结果表明，EA对AS的发生发展有较好的改善作用。 综上所述，EA可能结合在EGFR胞外段结构域来激活EGFR-ERK1/2信号通路，进而增加LDLR mRNA的表达以及EA增加FoxO3和降低HNF1α抑制PCSK9的表达，通过两种途径共同增加LDLR蛋白水平。使用EA naps在ApoE-/-小鼠体内验证EA改善AS的作用及分子机制。本研究结果为EA防治AS提供科学依据，也为EA等其他植物多酚在健康领域的应用和开发具有健康功效的食疗产品提供的理论依据和思路。 |
| 并列题名： | The effect and mechanisms of ellagic acid increasing LDLR to ameliorate atherosclerosis eng |
| 题名主题： | 鞣花酸 动脉粥样硬化 胆固醇代谢 LDLR PCSK9 学位论文 |
| 中图分类： | R285-533 |
| 个人名称等同： | 王立甜 著 |
| 个人名称次要： | 盛军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |