书目详细信息
： 重组人TNF-α蛋白表达、纯化及其与EGCG相互作用研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 重组人TNF-α蛋白表达、纯化及其与EGCG相互作用研究/.秦权著/.向泽敏， 柴子奇 |
| 出版发行项： | 2023.06.15 |
| 载体形态项： | 54页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2021240118 |
| 提要文摘： | 类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，其特征为持续性滑膜炎并伴随剧烈疼痛，严重者导致功能损害和残疾。患者体内表现为免疫细胞的浸润和多种促炎细胞因子的表达。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是由157个氨基酸残基组成的三聚体可溶性蛋白，位于多种促炎因子的顶端，是免疫调节的中枢因子，实现炎症的启动和维持，在类风湿性关节炎的发病机制中占主导地位，是治疗类风湿性关节炎的重要治疗靶点。研究表明，饮用绿茶有利于遏制自身免疫性疾病的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶中含量最丰富和活性最强的小分子化合物，具有显著的抗氧化和抗炎特性，已被证明能够改善类风湿性关节炎的症状。然而，EGCG以TNF-α为治疗靶点与其相互作用改善类风湿性关节炎的研究尚不深入。因此，本研究拟通过对重组TNF-α蛋白进行表达与纯化，获得高纯的TNF-α蛋白，进而探究EGCG与TNF-α蛋白的相互作用来改善类风湿性关节炎的作用机制。 实验室前期已成功构建了表达TNF-α的表达质粒（pET28-TNF-6His）。本研究首先将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中并进行目的蛋白的表达；优化目标蛋白的表达条件；在通过亲和层析等纯化技术，得到了高纯度的重组TNF-α蛋白。在此基础上，采用表面等离子共振（SPR）技术检测EGCG与TNF-α/TNFR1/TNFR2之间相互作用关系，通过L929细胞和293-NF-κB报告细胞，采用细胞毒性实验分析、荧光素酶报告基因方法分析，探究EGCG对TNF-α活性的影响。选用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS为细胞模型，采用MTT和蛋白免疫印迹（Western Blot）方法探究EGCG对RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NF-κB信号通路活化和细胞增殖的影响。主要研究结果如下： （1）琼脂糖凝胶电泳结果显示，pET28-TNF-6His质粒成功转化到大肠杆菌BL21（DE3）中； （2）SDS-PAGE电泳结果显示，大肠杆菌BL21（DE3）能成功表达出TNF-α蛋白； （3）为了优化重组蛋白TNF-α的诱导表达条件，对诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间四个方面进行探究。最优表达条件为0.1 mM IPTG为诱导剂、28℃诱导12 h； （4）通过Ni-NTA亲和层析柱使蛋白分离纯化，成功纯化出浓度为1.62 μg/μL、纯度高达96%的重组TNF-α蛋白； （5）在分子互作水平上，EGCG能够同TNF-α、TNFR1和TNFR2直接结合，具备相似的浓度亲和力，进而阻断TNF-α与其受体TNFR1、TNFR2之间的结合； （6）EGCG能够显著抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡，并且这种作用不是由于细胞毒性产生的； （7）EGCG可抑制293-NF-κB报告细胞中TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活化； （8）EGCG能够抑制RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NF-κB信号通路，遏制相关标志蛋白（IKKα/β、IκBα、P65）的活化。 综上所述，本研究通过重组蛋白的表达与纯化技术，成功得到TNF-α重组蛋白。发现EGCG能同TNF-α蛋白及其受体直接结合，破坏TNF-α同TNFR1与TNFR2之间的相互作用，抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路在RA-HFLS细胞中活化，进而遏制了炎症的过度活化，从而改善类风湿性关节炎的发生发展。因此，日常饮用绿茶中EGCG可能是预防性治疗TNF-α相关炎症疾病的潜在保健食品。 |
| 并列题名： | Expression and purification of recombinant human TNF-α protein and its interaction with EGCG eng |
| 题名主题： | 类风湿性关节炎 肿瘤坏死因子α NF-κB 成纤维样滑膜细胞 EGCG 学位论文 |
| 中图分类： | R593.22-533 |
| 个人名称等同： | 秦权 著 |
| 个人名称次要： | 向泽敏 指导 |
| 个人名称次要： | 柴子奇 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |