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： 小反刍兽疫病毒核酸标准物质制备和实时荧光定量RT-PCR检测方法建立
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 小反刍兽疫病毒核酸标准物质制备和实时荧光定量RT-PCR检测方法建立/.师亚玲著/.信吉阁, 艾军指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.9 |
| 载体形态项： | 67页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2021240454 |
| 提要文摘： | 小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）是一种严重的烈性、接触性传染病，是全球制定的控制和扑灭疫病之一。PPR发病率和死亡率较高，严重威胁着我国的动物卫生安全和畜牧业发展，并造成了巨大的经济损失。因此，探索一种快速有效的、标准化的检测方法对小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）的诊断和检测十分重要。但目前尚无一种通用的PPRV核酸标准物质，导致其定性、定量分析存在诸多困难。所以，建立小反刍兽疫病毒核酸检测的标准物质，是提高检测准确度，保证动物产品的质量和安全的关键。而在建立PPRV荧光定量RT-PCR方法时，加入内参基因GAPDH，可以对样本进行质控，提升检测的准确性，可用于小反刍兽疫的快速检测、流行病学调查和疫情监测等，有利于推动PPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法的标准化。本论文的研究内容包括以下两个方面： （1）小反刍兽疫病毒核酸标准物质的制备 本研究采用灭活后的病毒液制备小反刍兽疫病毒核酸标准物质。使用VERO细胞培养PPRV，收获病毒液后，56℃水浴中灭活4 h，灭活细胞盲传三代。收获病毒液，进行灭活检验。对PPRV灭活病毒液进行均匀性初检，将冻干保护剂与病毒液混匀后，进行分装，所得样品采取冻干处理。通过物理特性、无菌实验、支原体实验和其它病毒实验，并通过均一性评价实验，评价其短期、长期和复融稳定性。同时，通过与其他实验室的合作，对标准品进行校准，并对测量结果进行统计和处理，以保证其可信度的准确。在此基础上，综合考虑协作标定测量的均匀性、稳定性和不确定性，获得最终定值结果。试验结果显示灭活的病毒液盲传三代VERO细胞后，其病毒量没有增加。均匀性初检结果显示其分装前均匀性良好。PPRV核酸标准物质冻干后呈淡黄色固体，使用无菌水稀释后能充分溶解，呈澄黄色液体。灭活后的标准物质无菌；支原体检验，均为阴性；不含蓝舌病、口蹄疫O型、山羊痘、羊口疮、鹿流行性出血病等外源性病毒。核酸标准物的均匀性、稳定性较好。对均匀性测试的数据进行了方差分析，发现组间、组内均匀性没有明显的差别（P>0.05）。在室温、4℃、-20℃和37℃条件下贮存9天以及在常温、4℃、-20℃、-80℃存放6个月，均未见明显改变。由外部实验室共同完成标定工作，并对标定结果进行统计、分析和处理。将均匀性、稳定性和不确定度等因素引入到定值结果中，在置信率为95%时，该标准物质的定值结果为（4.8±0.45）×104 copies/μL。本研究制备的小反刍兽疫病毒核酸标准物具有较好的均匀性、稳定性，可用来评价实验室的检测方法以及选择检测试剂等。 （2）含内参小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立 本研究建立一种含有内参基因的小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR方法，选用国标GB/T 27982-2011《小反刍兽疫诊断技术》中荧光定量RT-PCR的引物和探针，并根据绵羊、山羊、鹿等小反刍动物GAPDH基因序列，选择一段保守序列设计一对内参基因GAPDH引物和探针，建立并优化实时荧光定量RT-PCR反应体系，进行特异性、敏感性、重复性检测试验。使用国标GB/T 27982-2011《小反刍兽疫诊断技术》中普通RT-PCR的方法与本研究建立的方法分别检测92份羊血液临床样本，并进行两种方法检测结果符合率的比较。实验结果显示，优化后PPRV最佳引物浓度为0.4 µmol/L，探针浓度为0.4 µmol/L，GAPDH最佳引物浓度为0.4 µmol/L，探针浓度为0.2 µmol/L。该方法能对PPRV进行特异性扩增，与蓝舌病、口蹄疫、山羊痘、羊口疮、鹿流行性出血病等常见小反刍动物易感病毒均无交叉反应，具有良好的特异性；PPRV、GAPDH标准曲线呈现良好的线性关系；PPRV最低检测限为6.8 copies/µL，GAPDH最低检测限为190 copies/µL，具有良好的敏感性；PPRV、GAPDH的组内、组间变异系数（CV%）均低于2%，具有较好的稳定性。92份羊血液临床样本检测结果显示，GAPDH均为阳性，PPRV检测为4份阳性，PPRV检测阴性为88份，与国标普通RT-PCR方法检测的PPRV阳性、阴性结果符合率为100％。本研究建立的含内参基因的小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR方法，特异性强、敏感性高、重复性好，加入内参基因对样本进行质控，提升了检测的准确性。 综上所述，本研究制备了小反刍兽疫病毒核酸检测标准物质，对该标准物质进行协作标定，提供可靠的参考值；建立了含内参基因的小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，加入内参基因对样本进行质控，提升了检测的准确性。本研究有利于完善小反刍兽疫病毒核酸检测体系，推动小反刍兽疫病毒检测方法的标准化。 |
| 并列题名： | Preparation of nucleic acid reference materials for peste des petits ruminants virus and establishment of real-time fluorescence quantitative RT-PCR detection method eng |
| 题名主题： | 小反刍兽疫病毒 核酸标准物质 实时荧光定量RT-PCR 内参基因 学位论文 |
| 中图分类： | S851.34-533 |
| 个人名称等同： | 师亚玲 著 |
| 个人名称次要： | 信吉阁 指导 |
| 个人名称次要： | 艾军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |