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： 云南省猪戊型肝炎病毒感染qRT-PCR检测和ORF2真核表达及重组蛋白免疫原性研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 云南省猪戊型肝炎病毒感染qRT-PCR检测和ORF2真核表达及重组蛋白免疫原性研究/.卓娜著/.陈培富，艾军指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.25 |
| 载体形态项： | 73页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210412 |
| 提要文摘： | 戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）是单股正链RNA病毒，现分为8个基因型，其中基因4型主要报道于中国。HEV感染猪一般无明显临床症状，但基因3型和基因4型可突破种属屏障，引起人流产和死亡，在发展中国家具有重要的公共卫生意义。HEV基因组包含ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2编码衣壳蛋白，在病毒粒子组装和病毒吸附宿主细胞过程中起关键作用，且是中和抗体的主要靶抗原。发展基于ORF2的猪用病毒样颗粒（VLP）疫苗，对防控该病对养猪业的危害和在人与猪之间的传播流行，具有重要的现实意义。 本研究自行建立荧光定量RT-PCR检测556份猪血清样品和846份猪粪便样品，HEV核酸阳性率分别为0.9%和9.1%。随后采用分子生物学信息方法对基因4型猪源戊型肝炎病毒（swine Hepatitis E virus，sHEV）的ORF2进行功能预测及分析，寻找保护性抗原编码区，结果显示ORF2编码p496和p476蛋白2个稳定蛋白，p496蛋白含496个氨基酸，p476蛋白含476个氨基酸，二者皆属于无跨膜区的亲水性蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。p496蛋白有11个T细胞表位和21个B细胞表位，p476蛋白有14个T细胞表位和18个B细胞表位。选取p496、p476对应的优势肽段128-623aa、140-615aa进行真核表达，同时表达全长衣壳蛋白p674，对比三者形成VLP的差异。具体说，通过PCR扩增、酶切、连接、转化等步骤，构建ORF2（674）、ORF2（496）和ORF2（476）的昆虫细胞表达载体pFastBac-HTB-sHEV-ORF2（674/496/476），将重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10 Bac感受态细胞，得到重组穿梭质粒Bacmid-sHEV-ORF2（674/496/476），用Cellfectin Reagent Ⅱ介导质粒转染sf9细胞，收获及纯化重组蛋白，应用蛋白质杂交技术（Western blotting）检测重组蛋白，结果显示可被His标签单抗、猪戊型肝炎病毒抗体阳性血清识别的蛋白质条带，透射电镜检测到p496和p476形成了VLP。 为构建具有免疫原性的sHEV候选疫苗，通过小鼠试验对p674、p496和p476重组蛋白的免疫原性进行初步评价。用建立的基于重组蛋白的间接ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体水平，结果显示p674能够引起免疫应答的最低有效剂量为10μg/只，p496和p476为2μg/只，注射剂量为10μg/只时p496、p476组抗体阳性率达85%以上，注射剂量为20μg/只时所有小鼠均产生抗体，表明重组蛋白及其形成的VLPs引起机体明显的抗体应答。 综上所述，sHEV p496和p476形成的VLPs较p674具有良好的免疫原性，为进一步研制猪戊型肝炎候选疫苗的奠定了基础。 |
| 并列题名： | qRT-PCR detection of HEV infection in swine in Yunnan Province and ORF2 eukaryotic expression and study of immunogenicity of the recombinant protein |
| 题名主题： | 猪戊型肝炎病毒 ORF2 表位 昆虫细胞杆状病毒 学位论文 |
| 中图分类： | S828-533 |
| 个人名称等同： | 卓娜 著 |
| 个人名称次要： | 陈培富 指导 |
| 个人名称次要： | 艾军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |