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： 兰花叶斑艺相关基因的遗传转化体系及技术研究
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| ISBN/价格： | CNY20.00(估)缴送 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 兰花叶斑艺相关基因的遗传转化体系及技术研究/.刘丹著/.王玉英指导 |
| 出版发行项： | 2018.05.30 |
| 载体形态项： | 62页:;+图表:;+30cm |
| 提要文摘： | 兰花因其花色淡雅，叶姿优美，芳香四溢，可做盆花或切花，深受各国人民的喜爱。其中兰花叶斑艺品种观赏价值很高，是国际“天价兰花”的重要特征，但商品叶艺兰品种选育时间长且艺象不稳定，选育周期较长，优良品种的兰花数量少，很难满足市场需求，基因工程技术为培育兰花新品种开辟了新道路。因此，本研究以兰花黄色素花虎头兰（Cymbidium tracyanum var huanghua）与黄蝉兰（C.iridioides D.Don）杂交F1正常绿色植株为材料，结合前期辐射诱发艺象稳定的叶斑艺植株和差异表达F3’5’H和Rubisco基因EST序列，研究叶斑艺兰花相关基因的遗传转化体系及技术，为兰花基因工程育种提供理论参考依据，同时为叶艺型兰花新品种培育提供种质资源。主要研究结果如下： 1、为了构建兰花高频再生体系，本研究以黄色素花虎头兰（C.tracyanum var huanghua）与黄蝉兰（C. iridioides D.Don）杂交F1植株组培苗（TRIR-1）的原球茎、茎尖和叶片基部为材料，在无菌条件下，研究不同激素配比对原球茎受体系统建立的影响。结果表明：TRIR-1原球茎增殖效果最好的是原球茎材料：1/2MS +1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.5g/L花宝1号+0.5g/L碳粉+80g/L香蕉泥为最佳配方，增殖倍数为4.5倍,最佳分化培养基为1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.1 mg/LKT+1.5g/L花宝1号+0.5g/L碳粉+80g/L香蕉泥，分化率为38.80%，且原球茎浓绿色和长势健壮；最佳生根培养基为1/2MS+0.3mg/L6-BA+1.5mg/LNAA+1.5g/L花宝1号+0.5g/L碳+80g/L香蕉泥，生根率达到100%，平均株根数为4.69条，平均根长为7.31cm，植株长势健壮，叶片浓绿。 2、通过RACE技术获得F3’5’H基因全长cDNA2467bp，编码503个氨基酸组成的蛋白，含有信号肽，是分泌蛋白。同源性比对和系统进化树分析结果显示F3’5’H蛋白与石斛兰的同源性最高为89.74%，具有保守的蛋白质结构域包含CYP（细胞色素P450）基序、I螺旋基序和血红素结合域。 3、通过RACE技术获得Rubisco基因全长cDNA1669bp，编码438个氨基酸组成的蛋白，无信号肽，亚细胞定位于叶绿体中。同源性比对和系统进化树分析结果显示Rubisco蛋白与石斛兰的同源性最高为85.0%，具有高度保守的ATP结合基序，分别为“WGGKGQGKS”（A区） 和“GKMCCLFINDLD”（B区）。 4、原球茎对抗生素的敏感性实验结果显示：未经转化的（TRIR-1）原球茎对潮霉素（Hyg）的敏感性很高。Hyg浓度为50mg/L时，原球茎的成活率仅为8.6%，确定为TRIR-1原球茎筛选的最佳抗生素及浓度。原球茎对卡那霉素（Kana）和头孢霉素（Cef）不敏感，浓度分别高达600mg/L和500mg/L时，原球茎依然保持绿色；且当头孢霉素浓度为250mg/L时，原球茎长势更好，确定为最佳的抑菌剂。 5、构建了F3’5’H基因的过量表达载体pCAMBIA-F3’5’H，同时利用CRISPR /Cas9 系统构建了含有靶位点Cas9-1和Cas9-9的Rubisco基因敲除载体pCAMBIA 1300DM-OsU6(AarI)-Cas9，载体均含有潮霉素（Hyg）抗性基因，并成功将载体质粒转入农杆菌EHA105中，获得用于转化植物的工程菌。采用菌液OD600为0.6-0.8的农杆菌EHA105对TRIR-1原球茎进行了转化。经过50d的筛选培养，获得34个具有潮霉素（Hyg）抗性的原球茎，其中基因F3’5’H的最高转化率为3%，基因Rubisco的最高转化率为1.0%。 |
| 并列题名： | Study on Genetic Transformation System and Technology of related genes in Cymbidium with variegated leaf eng |
| 题名主题： | 兰花 高频再生体系 RACE 载体构建 遗传转化 学位论文 |
| 中图分类： | S682.31-533 |
| 个人名称等同： | 刘丹 著 |
| 个人名称次要： | 王玉英 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20190329 |