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： 利用CRISPR/Cas9技术构建印迹基因NNAT-CTCF结合位点修饰的细胞模型
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 利用CRISPR/Cas9技术构建印迹基因NNAT-CTCF结合位点修饰的细胞模型/.蔡洁著/.赵红业指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.13 |
| 载体形态项： | 58页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 植物保护学院, 学号2020210309 |
| 提要文摘： | 孤雌生殖普遍存在于植物和低等脊椎动物中。在植物中，孤雌生殖主要应用于作物育种，它能使植株快速纯合是获得植物新品种的重要途经之一。在哺乳动物中，印迹基因异常表达是限制孤雌生殖的主要原因。印记基因Neuronatin（NNAT）位于猪17号染色体末端。已有研究表明在小鼠中CCCTC结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）调控印迹基因NNAT的表达，但在猪孤雌发育中报道较少。本研究针对NNAT-CTCF结合区域设计了CRISPR/Cas9打靶载体，构建NNAT-CTCF结合位点敲除（Knockout，KO）猪孤雌细胞模型，为母系印迹基因NNAT的表达调控、猪孤雌早期生殖发育及其分子机制的研究奠定了基础。 本研究通过q-PCR和Western blot技术检测野生型胎儿成纤维细胞系（WT1♂和WT2♀）、猪孤雌胎儿成纤维细胞系（PA1、PA2、PA3和PAD-7）和猪髋动脉内皮细胞（PIEC）中母系印迹基因NNAT的mRNA和蛋白表达水平以及BLCAP的mRNA表达水平；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，根据NNAT启动子附近的CTCF结合序列，在线设计合成4条单链向导sgRNA，构建打靶载体；脂质体和电穿孔转染方法将载体分别转染猪孤雌胎儿成纤维细胞和猪髋动脉内皮细胞。流式分选阳性细胞群，提取细胞基因组后采用PCR技术扩增出目的条带，将PCR产物进行Sanger测序和T7 Endonuclease Ⅰ（T7EN Ⅰ）酶切验证sgRNA的打靶效率；电穿孔转染的方法进一步将打靶效率高的PGL3-U6-NNAT-CTCFsgRNA-EGFP载体共同转染猪孤雌胎儿成纤维细胞和猪髋动脉内皮细胞。流式分选阳性细胞群，提取细胞基因组后采用PCR技术扩增出目的条带，将PCR产物和TA克隆进行Sanger测序鉴定基因型。实验结果如下： 1.Western blot结果显示，与野生型猪胎儿成纤维细胞（WT1、WT2）相比，G0代猪孤雌胎儿成纤维细胞（PAD-7）的NNAT蛋白不表达（P<0.05）；q-PCR结果显示，与WT1、WT2相比，PA1、PA2、PA3和PIEC的NNAT mRNA表达水平显著降低（P<0.05）；PA1和PA3的BLCAP mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。 2.成功构建了4个靶向CTCF结合区域的sgRNA。采用脂质体转染的方法，将sgRNA转染猪孤雌胎儿成纤维细胞后，通过流式细胞术、PCR扩增技术、Sanger测序和T7EN Ⅰ 酶切技术验证了sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3与spCas9共转后均有打靶效率，分别为9.09%，8.33%和0.99%。 3.脂质体与电穿孔转染结果显示，在猪孤雌胎儿成纤维细胞中，电穿孔转染效率分别为6.60%、12.0%、9.73%和4.76%，脂质体转染效率分别为2.61%、5.57%、5.88%和3.39%，电穿孔转染效率均比脂质体转染效率高；电穿孔共转染sRNA1+sgRNA3与spCas9载体后，猪孤雌胎儿成纤维细胞系有打靶效率，TA克隆的Sanger测序敲除55 bp的基因型；电穿孔共转染sgRNA1+sgRNA3与spCas9载体，sgRNA2+gRNA3与spCas9载体，猪髋动脉内皮细胞系均无打靶效率。 综上所述，本研究结果表明母系印迹基因NNAT在猪孤雌胎儿成纤维细胞中表达缺失，并且成功获得了NNAT-CTCF结合位点敲除的猪孤雌胎儿成纤维细胞，为母系印迹基因NNAT的表达调控、猪孤雌早期生殖发育及其分子机制的研究奠定了基础，为进一步修复猪孤雌生殖中印迹基因表达异常的研究提供思路。 |
| 并列题名： | Construction of Imprinted gene NNAT-CTCF Binding Site Modified Cells Using CRISPR/Cas9 Technology eng |
| 题名主题： | CRISPR/Cas9 NNAT CTCF结合因子 猪孤雌胎儿成纤维细胞 学位论文 |
| 中图分类： | Q782-533 |
| 个人名称等同： | 蔡洁 著 |
| 个人名称次要： | 赵红业 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240528 |