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： 云南部分地区牛腹泻病毒性病原遗传进化分析
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 云南部分地区牛腹泻病毒性病原遗传进化分析/.施徐森著/.李文贵， 李金存指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.31 |
| 载体形态项： | 67页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2021240461 |
| 提要文摘： | 病毒感染是导致牛腹泻的重要因素，而牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）、牛轮状病毒（Bovine Rotavirus,BRV）和牛纽布病毒（Bovine Nebovirus，BNeV）是当前导致牛群发生病毒性腹泻的四种主要病原，常有混合感染，对我国养牛业危害巨大。这四种病毒感染临床症状以腹泻、肠炎为主要特征，临床确诊有赖于实验室病原检测。本研究通过建立了BVDV、BCoV、BRV及BNeV的四重RT-PCR检测方法，对2022.6-2023.4月云南牛场腹泻犊牛样品中四种病毒进行检测，在此基础上对BRV的VP6、BVDV的5’UTR 序列进行遗传进化分析，具体研究如下: 1. 腹泻牛群BRV、BCoV、BVDV、BNeV 感染情况调查 针对BRV的VP6基因、BCoV的NSP2基因、BVDV的5’UTR 及BNeV的RDRP基因分别设计特异性引物，目的片段分别为380 bp、330 bp、260 bp、120 bp。经过对退火温度、引物浓度进行并进行优化后，BRV、BCoV、BVDV、BNeV的最佳退火温度均为58℃，四种检测方法的最佳引物浓度BRV为0.4 µmol/L、其它三种为0.8 µmol/L。特异性试验结果显示，仅四种靶病毒检测呈阳性，而对牛群常见病毒BNV、BKV、BNOV不能检出，四种病毒单一RT-PCR特异性良好。敏感性试验结果显示，对BRV、BNeV、BCoV、BVDV的最低检测量分别为2.72×103 copies/μL、3.32×103 copies/μL、3.86×103 copies/μL、1.06×103 copies/μL，敏感性好。 应用所建立四种病毒的PCR检测方法，对云南部分地区的322份临床样品进行检测。结果BRV检出率为40.37% (130/322)、BCoV检出率为13.04%（42/322）、BVDV检出率为10.87%（35/322）、BNEV检出率为1.24%（4/322），两个混合感染的BRV＋BCoV检出率为9.94%（32/322），BRV＋BVDV检出率为4.66%（15/322），BCoV＋BVDV检出率为1.24%（4/322）。 2. BRV、BCoV、BVDV、BNeV 四重PCR检测技术的建立 为了提高检测效率，本研究对应用上述4对引物建立四重PCR检测法进行了尝试。PCR扩增条件优化结果，四重RT-PCR的最佳退火温度为58 ℃，BRV、BNeV、BCoV、BVDV的最佳引物浓度分别为0.4 µmol/L、0.4 µmol/L、0.4 µmol/L、0.4 µmol/L，BRV、BNeV、BCoV、BVDV的最低检测量分别为2.72×103 copies/μL、3.32×103 copies/μL、3.86×103 copies/μL、1.06×103 copies/μL与BEV、BKV、BNOV无交叉反应，且4次重复试验条带清晰正确且一致，从而建立了四重RT-PCR检测法，具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点。对部分临床样品的检测结果，与单一PCR检测结果一致，说明本法可用于临床样品的检测。 3. BRV的VP6、BVDV的5’UTR序列测定及进化分析 为了进一步掌握云南流行株的遗传进化情况，在BRV和BVDV在扩增片段测序的基础上，对有代表性的BRV的VP6、BVDV的5’UTR序列测定及进化分析。选择BRV、BVDV优势流行毒株，对BRV VP6及BVDV的5’UTR基因扩增，获得BRV VP6基因的4株（命名为BRV-VP6 WS、BRV-VP6 KM、BRV-VP6 QJ、BRV-VP6 ZT），VP6基因全长1194 bp，编码397aa。获得3条5’UTR基因（命名为BVDV-5’UTR QJ、BVDV-5’UTR DL和BVDV-5’UTR LC）。每条BVDV 5’UTR基因全长280 bp。基于VP6和5’UTR基因的遗传进化分析显示:云南BRV分离株组内核苷酸序列同源性为96% ～ 98.6%；与其他参考毒株比较中，云南分离株与2020年河北分离的HB-BD (登录号：MN047454.1)毒株的同源性为95.4～98.1%,与2022年四川分离的毒株SCMY1(登录号：ON012967.1)同源性为95.7～98.4%，其而与韩国毒株的同源性最低，为75.5～77.5%。因此，云南分离株与我国四川和河北毒株关系更近。云南BVDV分离株组内核苷酸序列同源性为95.3～100%；与其他参考毒株比较中，云南BVDV分离株与2015年墨西哥分离的62-MGL(登录号：LC043220.1)毒株的同源性为93.6～94.9%；而与巴西毒株的同源性最低，为67.7～68.1%。遗传发育树结果显示，本实验中4条VP6基因同中国四川毒株SCMY1（登录号 ON012967.1）、SCMY2（登录号 ON012978.1）和河北毒株HB-BD（登录号MN047454.1），进化距离很近。本实验5’UTR基因与其他测序基因不同的分枝，云南BVDV毒株进化距离近，毒株BVDV-5’UTR DL和毒株BVDV-5’UTR LC基因进化距离较近。 |
| 并列题名： | Genetic evolution of bovine diarrhea viral pathogens in part areas of Yunnan Province eng |
| 题名主题： | BRV BCoV BVDV BNeV 多重RT-PCR 遗传进化分析 学位论文 |
| 中图分类： | S858.23-533 |
| 个人名称等同： | 施徐森 著 |
| 个人名称次要： | 李文贵 指导 |
| 个人名称次要： | 李金存 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |