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： 拉帕替尼衍生物抑制EGFR H773_V774 insH突变的作用机制
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 拉帕替尼衍生物抑制EGFR H773_V774 insH突变的作用机制/.爨向丹著/.盛军指导 |
| 出版发行项： | 2022.12.13 |
| 载体形态项： | 114页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院,学号2019110015 |
| 提要文摘： | 表皮生长因子受体（EGFR）过表达、突变等导致的EGFR过度活化是肿瘤的驱动因素之一，抑制EGFR的活化能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，缓解癌症的进展。EGFR是许多癌症，包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的重要治疗靶点。其中，EGFR 20号外显子插入（EGFR ex20ins）突变是包含一系列EGFR突变型的总称，其中包括：H773_V774 insH（简称EGFR-insH）、D770_N771 insSVD、D770_N771 insGY、D770_N771 delDinsGY、D770_N771 insGL、V769_D770 insASV、M766_A768 insASV、H764_V765 insHH、A763_Y764 insFQEA等。在众多突变中，EGFR-insH占比最高，约占所有EGFR 20号外显子插入突变的25.5%，除A763_Y764 insFQEA突变外，EGFR ex20ins突变对常规TKIs治疗不敏感。因此，为患有EGFR ex20ins突变的患者找到更有效的治疗方法非常重要。 由于缺乏患者来源或基因工程小鼠模型，目前关于EGFR ex20ins突变体的实验数据都来自于体外人工创建的代用细胞系模型。在此基础上，本研究使用Ba/F3细胞作为只表达单一突变基因的细胞模型；使用NCI-H292细胞作为具有疾病相关背景的细胞模型。通过一系列生物学实验探究拉帕替尼对EGFR H773_V774 insH突变型的NSCLC的抗肿瘤效应与作用机制，基于此研究得到如下结果： 1.构建EGFR 20号外显子插入突变细胞模型。使用电转染的方法瞬时转染并用抗生素进行筛选，然后单克隆筛选后对构建的细胞进行鉴定。使用MTT和流式细胞术检测发现，Ba/F3 H773_V774 insH（Ba/F3-insH），Ba/F3 D770_N771 insGY（Ba/F3-insGY），Ba/F3 A767_V769 dupASV（Ba/F3-dupASV），Ba/F3 D770_N771 delDinsGY（Ba/F3-delDinsGY），Ba/F3 EGFR WT（Ba/F3-WT）和NCI-H292 H773_V774 insH（NCI-H292-insH）细胞的阳性率都在95%以上。蛋白免疫印迹实验结果显示，Ba/F3细胞本身不表达EGFR而Ba/F3-insH，Ba/F3-insGY，Ba/F3-dupASV，Ba/F3-delDinsGY，Ba/F3-WT以及NCI-H292-insH细胞高表达EGFR；在细胞增殖实验中，该细胞模型能够在H773_V774 insH，D770_N771 insGY，A767_V769 dupASV，delD770 insGY，EGFR-WT基因的驱动下正常生长，且不受白介素-3（IL-3）的影响。以上结果表明，构建的Ba/F3-insH，Ba/F3-insGY，Ba/F3-dupASV，Ba/F3-delDinsGY，Ba/F3-WT和NCI-H292-insH细胞可以用于后续的实验研究。 2.针对Ba/F3-insH细胞，NCI-H292-insH细胞的靶向抑制策略筛选。首先通过蛋白免疫印迹实验探究了五种EGFR-TKIs（吉非替尼，拉帕替尼，厄洛替尼，安罗替尼，埃克替尼）在短时间内对EGFR磷酸化的影响。结果发现，使用替尼单独处理1h或两两（1h+5min）联合处理Ba/F3-insH细胞，在短时间（5min）条件下，只要存在拉帕替尼，EGFR的磷酸化水平就能被显著抑制。即在BaF3-insH细胞上，非共价结合型TKI拉帕替尼短时间（5min）即可有效抑制EGFR-insH的磷酸化，在较长时间（4h）后不能抑制EGFR-insH的磷酸化。通过MTT实验检测了不同浓度的拉帕替尼处理NCI-H292细胞，NCI-H292-insH细胞48h后对增殖抑制的影响，结果显示拉帕替尼对NCI-H292-insH细胞的增殖没有影响。这些结果表明：在短时间内，拉帕替尼可以仅通过结合EGFR-insH胞外段，即可抑制EGFR-insH的活化（磷酸化）。随着时间的延长，拉帕替尼逐渐进入细胞内，但其与EGFR-insH胞内酪氨酸激酶结构域不能良好结合（EGFR-insH的胞内激酶结构域的ATP结合口袋更为狭窄，不利于拉帕替尼的结合），随着胞外拉帕替尼浓度的降低，其胞外的结合/效应逐渐降低，抑制效果下降，最后消失。 3.拉帕替尼氨基酸类衍生物生物学实验。通过化学修饰合成拉帕替尼非跨膜衍生物来降低拉帕替尼进入细胞内的时间，探究拉帕替尼衍生物对Ba/F3-insH以及NCI-H292-insH细胞的影响。主要结果如下：通过MTT检测拉帕替尼氨基酸类衍生物和拉帕替尼在配体存在的情况下对NCI-H292-insH细胞增殖的影响。结果发现，与拉帕替尼相比，化合物39可显著抑制细胞的增殖。蛋白免疫印迹结果显示，在EGF和TGF-α存在的情况下，化合物39能够有效抑制EGFR的磷酸化，但是选择性较差。 4.拉帕替尼糖苷修饰物的合成与效应研究。首先通过click反应得到了拉帕替尼糖苷修饰物化合物9，通过MTT和蛋白免疫印迹实验检测化合物9在配体存在的情况下对NCI-H292-insH细胞增殖的影响。结果发现，与拉帕替尼相比，化合物9可显著抑制细胞的增殖和EGFR以及下游ERK的磷酸化。同时，异种移植实验说明，化合物9可以抑制移植瘤的生长且对体重没有影响。 5.化合物9与EGFR胞外结合效应。通过对化合物9与EGFR胞外段结合位点分析，选择了可能的结合位点，通过分子对接模拟和分子动力学研究发现，与拉帕替尼相比，化合物9可能与活化状态下EGFR胞外结构域的头部区域结合，且化合物9与EGFR的氨基酸残基形成了更多的氢键和更强的疏水作用力，氢键在EGFR-拉帕替尼/化合物9复合物的相互作用中发挥了重要作用。 综上所述，通过电转染构建稳定表达EGFR-insH细胞系，合成基于Lapatinib非跨膜衍生物，筛选到化合物9可以抑制EGFR及其下游ERK的磷酸化水平并抑制肿瘤的生长。提示化合物9可能是靶向EGFR-insH的有效化合物，为针对靶向20号外显子插入突变的药物开发提供了新的研究思路。 |
| 并列题名： | Mechanism of lapatinib derivatives to inhibit EGFR H773_V774 insH mutation eng |
| 题名主题： | EGFR-insH EGFR-TKIs 拉帕替尼 衍生物 学位论文 |
| 中图分类： | R914-533 |
| 个人名称等同： | 爨向丹 著 |
| 个人名称次要： | 盛军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240411 |