书目详细信息
： 抗A型塞内卡病毒天然产物筛选及颉颃作用机制初探
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 抗A型塞内卡病毒天然产物筛选及颉颃作用机制初探/.蒙英雯著/.邹丰才指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.29 |
| 载体形态项： | 69页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210414 |
| 提要文摘： | A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）为小RNA病毒科（Picornaviridae）塞内卡谷病毒属中的唯一成员。猪塞内卡病毒病临床主要表现为病猪口鼻、吻突及蹄冠等部位皮肤或黏膜处的水泡样病变。SVA可感染各年龄阶段猪群，严重时可造成新生仔猪的急性死亡。2014年始，SVA从最开始爆发疫情的美国、加拿大、巴西等美洲国家迅速传播至中国、泰国等世界主要生猪养殖国家。截止2018年，SVA便已流行于中国绝大部分省市及自治区，给全国以及全球养猪业造成了严重经济损失。如今，猪塞内卡病毒病预防和治疗措施均尚未明确，及时开发具有SVA颉颃活性的药物已然迫在眉睫。天然产物来源广泛，易于获取，化合物库作为药物筛选的重要工具，决定了小分子药物研发的速度和质量。本研究通过利用荧光素酶高通量筛选技术与实时荧光定量PCR技术相结合的方法，对囊括2700余种天然产物的化合物库进行抗SVA活性筛选，最终得到8种低毒高效的天然产物活性分子。通过研究8种天然产物的SVA颉颃作用机制，发现8种活性分子的颉颃作用路径各不相同。天然产物筛选及SVA颉颃作用机制研究具体内容如下： 关于颉颃SVA天然产物的筛选，利用BHK-21细胞与稳定表达荧光素酶的重组报告病毒rSVA-NLuc，结合荧光素酶报告系统高通量筛选技术，建立体外药物筛选平台，选用含2700余种天然产物的化合物库对其进行高通量筛选。高通量筛选结果显示，该化合物库中共有33种对rSVA-NLuc表现颉颃活性。与空白组相比，感染rSVA-NLuc的细胞经33种天然产物处理后，rSVA-NLuc的荧光素酶水平均显著降低，表明这33种天然产物抑制了rSVA-NLuc的体外增殖，最终导致该处理组荧光素酶水平下降。为消除高通量筛选过程中可能出现的假阳性结果，对从荧光素酶初筛选得到的33种候选天然产物，选用逆转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进一步验证其颉颃SVA活性，并通过反映乳酸脱氢酶（LDH）释放水平的细胞毒性实验确定最大无毒浓度。最终，共得到紫堇灵（Corynoline）、甲磺酸溴隐亭（Bromocriptine (mesylate)）、木犀草素四甲醚（5,7,3',4'-Tetramethoxyflavone）、银杏素（Ginkgetin）、20S-原人参三醇（20S-Protopanaxatriol）、蕈青霉素（Paxilline）、方胆碱（Fangchinoline）、竹红菌乙素（Hypocrellin B）8种10μM时具有颉颃SVA活性的活性分子。其中前4种天然产物即紫堇灵、甲磺酸溴隐亭、木犀草素四甲醚、银杏素安全浓度达100μM，后4种天然产物最大安全浓度为25μM。 关于天然产物颉颃SVA作用机制的研究，由于20S-原人参三醇、蕈青霉素、方胆碱、竹红菌乙素最大安全浓度仅为25μM，细胞毒性较大，所以后续主要针对细胞毒作用较小的另4种化合物进行SVA颉颃作用机制的研究。首先利用多种技术综合评估4种化合物在不同时间点对BHK-21细胞内SVA增殖的影响。通过Western blot实验，发现4种化合物可以在不同时间点（8h、12h、24h、36h）均有效抑制SVA感染。通过免疫荧光实验（IFAs），发现在SVA 感染BHK-21细胞24h后4种化合物处理有效抑制了SVA感染。通过反映半数组织细胞感染量（TCID50）的病毒滴度的测定，发现4种化合物在感染开始24h、36h后均抑制了SVA感染。为了明确4种天然产物对BHK-21细胞内病毒生命周期各个阶段的影响，联立qRT-PCR、Western blot、IFAs以及病毒滴度TCID50测定4种技术方法分别对病毒生命周期吸附、入胞、复制、组装及释放独立开展了研究。研究结果表明，紫堇灵在SVA生命周期的各个阶段均发挥了抑制作用；甲磺酸溴隐亭在SVA感染早期即吸附、入胞阶段不表现抑制，而在感染后期即复制、组装及释放阶段表现明显抑制；木犀草素四甲醚除了吸附阶段不表现抑制之外，其余阶段均表现明显抑制；银杏素除了入胞阶段不表现抑制，吸附、复制、组装及释放阶段均发挥了明显的抑制作用。由此可见，4种天然产物对BHK-21细胞内SVA生命周期的颉颃机制各有不同，如将4种天然产物混合使用，使颉颃作用存在于病毒生命周期的各个阶段，有望达到更好的抗病毒效果。另4种最大安全浓度仅为25μM的天然产物作用机制研究表明，20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的吸附、复制阶段；蕈青霉素及竹红菌乙素在SVA的吸附、入胞、复制、组装释放阶段即整个病毒感染周期均发挥抑制作用；方胆碱能够抑制SVA的入胞、复制。 本研究从天然产物库中筛选出了8种具有抗SVA活性的天然产物紫堇灵、甲磺酸溴隐亭、木犀草素四甲醚、银杏素、20S-原人参三醇、蕈青霉素、方胆碱和竹红菌乙素，这些化合物抗病毒效果良好，如在这些化合物结构基础上对其进行适当改造，有望获得更为低毒高效的抗SVA化合物，助力SVA防控。 |
| 并列题名： | Screening and preliminary study on the mechanism of antagonism of the natural products against Senecavirus A eng |
| 题名主题： | A型塞内卡病毒（SVA） 天然产物 高通量筛选 颉颃机制 学位论文 |
| 中图分类： | S858.28-533 |
| 个人名称等同： | 蒙英雯 著 |
| 个人名称次要： | 邹丰才 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240520 |