书目详细信息
： “off-on”型EGFR荧光探针的构建及在食药同源活性分子筛选中的应用
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | “off-on”型EGFR荧光探针的构建及在食药同源活性分子筛选中的应用/.王丽霞著/.王宣军指导 |
| 出版发行项： | 2022.12.13 |
| 载体形态项： | 111页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院,学号2019110012 |
| 提要文摘： | 食药同源资源的深入研究与挖掘是大健康产业发展的基础。各类食品原料中的功能因子如多酚、多糖和萜类等成分亟需深入研究，明确其作用靶点和作用机制，可为慢性疾病的预防、辅助治疗以及营养干预等提供科学依据。癌症是严重威胁人类生命健康的一种疾病，其治疗与预防是生命科学领域与营养健康领域面对的共同难题。基于特定靶点的分子靶向治疗已成为目前癌症治疗的主要方式，其中表皮生长因子受体(EGFR)是癌症分子靶向治疗领域研究最早最深入的靶点，其异常突变和过度活化严重影响肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和转移等。食药同源资源富含多种抗肿瘤活性成分，其中也包括一些能够显著抑制EGFR活性的功能活性因子。因此，从食药资源中挖掘筛选具有EGFR抑制活性的功能活性分子是一种新策略，同时可为食药资源抑癌防癌提供理论指导。 EGFR抑制剂的筛选主要是通过体外激酶活性进行筛选，此筛选方法是一种分子水平的体外筛选方法，众多候选分子在后续的活细胞实验中无效，具有一定的局限性。针对食药同源资源及食品原料中的天然化合物开发EGFR抑制剂的进程缓慢，高效的细胞水平的筛选体系则有望加速EGFR抑制剂的开发。小分子荧光探针以其高灵敏度及特异靶向性等优点，已广泛应用于疾病诊断和药物筛选。使用荧光探针在细胞水平上进行筛选，可以通过定量读取荧光强度等参数指标，直接评估化合物与相应靶点的结合变化，是一种灵敏度高且快速高效的筛选方式。本研究基于荧光探针技术，通过构建具有显著“off-on”响应效应的EGFR靶向荧光探针，基于EGFR抑制剂与探针可竞争性结合ATP疏水口袋，导致荧光信号强度下降的原理建立了一种细胞水平的EGFR抑制剂筛选体系，并进一步评价了筛选体系的可靠性。采用基于该探针建立的EGFR抑制剂筛选体系，对四十种食药资源来源的天然化合物进行筛选，一种来源于食药植物卡瓦胡椒的查尔酮类化合物卡瓦胡椒素A可使荧光信号强度显著下降，并通过一系列实验进一步证实了FKA可通过调控EGFR信号通路进而抑制过表达EGFR肿瘤细胞的增殖，是一种潜在的EGFR抑制剂，表明本研究建立的筛选体系可用于食药资源中具有调控EGFR活性的功能活性成分的快速筛选。本论文主要研究内容如下： （1）环境敏感策略基于具有溶剂化变色功能的荧光染料，使探针在不同极性环境中实现荧光颜色和亮度的变化，是一种构建具有“off-on”响应的非酶蛋白探针的一种新兴策略。本研究基于环境敏感策略，以吉非替尼为母核，在其6位溶剂化区域引入了两类具有环境敏感性的小分子荧光团丹磺酰氯(DNS)和7-硝基苯并呋咱(NBD)，设计合成了Gefitinib-DNS和Gefitinib-NBD两个系列荧光探针，并对探针的紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、量子产率以及环境敏感性等光学性质进行了评价，发现Gefitinib-NBD系列探针具有很好的环境敏感性。 （2）通过测试探针分子的光学性质并结合其抗增殖活性，筛选出环境敏感性良好且活性与吉非替尼相当的探针分子，命名为GN3。在分子水平和细胞水平详细探究了探针GN3的EGFR靶向功能：通过分子互作系统检测了GN3与EGFR激酶域的分子实时相互作用，结果显示GN3与EGFR有显著亲和能力；对GN3与EGFR蛋白进行分子对接模拟，发现GN3能够很好的与EGFR蛋白的ATP结合口袋结合；蛋白质免疫印迹(WB)实验证实GN3能显著抑制A431细胞中磷酸化EGFR的表达水平；以上结果证实了GN3能很好的进入到ATP结合口袋，具有特异性的EGFR靶向能力。接着又对GN3基于EGFR的“off-on”响应进行了探究，发现该探针在蛋白水平和活细胞水平都有显著的基于EGFR的荧光“off-on”响应特征。共聚焦成像结果显示，GN3可以特异性地对过表达EGFR的A431细胞做出荧光响应，且在阳性药物吉非替尼存在下，荧光信号亮度明显减弱，证实GN3具有良好的靶向EGFR的成像能力，同时阳性药物吉非替尼可在一定程度上阻断GN3与EGFR结合。小动物活体成像结果显示探针GN3可在荷瘤裸鼠体内对携带EGFR的肿瘤有效识别，具有很好的体内肿瘤靶向成像能力。 （3）EGFR抑制剂与探针竞争性结合ATP结合口袋后，导致荧光信号减弱，因此可以根据荧光信号强度值来反应化合物与探针的竞争性结合能力，间接反应化合物与EGFR的ATP结合域的结合能力。实验结果显示，在细胞水平上，EGFR抑制剂吉非替尼和拉帕替尼与GN3共孵育可导致荧光信号下降，且该荧光信号强度变化可通过多功能酶标仪直接测定，而常用的几种非EGFR抑制剂类抗肿瘤药物如紫杉醇、喜树碱等则不会引起荧光信号强度改变，证实基于竞争性结合机理建立EGFR抑制剂筛选体系的可行性。通过对探针使用浓度、孵育时间以及EGF刺激时间等条件进行优化，建立了一个细胞水平的EGFR抑制剂的筛选体系，该体系在96孔板中完成筛选，操作方便快捷。同时，为了进一步验证本体系的可靠性，筛选了24种替尼衍生物，并应用MTT法和WB法检测了筛选的替尼衍生物对A431细胞抗增殖抑制效应以及对磷酸化EGFR表达水平的影响，所得结果均与本筛选体系所得结论一致，进一步证实了本体系的可靠性。 （4）基于本研究建立的筛选体系对40种天然化合物进行了筛选，发现一种来自食药同源植物卡瓦胡椒的查尔酮类化合物卡瓦胡椒素A能显著引起荧光强度下降，提示为一种潜在的EGFR抑制剂。同时，应用MTT法探究了所筛选的40种天然化合物对A431细胞的抑制效应，发现包括卡瓦胡椒素A在内的6种化合物对A431的增殖有抑制效果，通过WB实验检测这6种化合物对本体系所选用的A431细胞中磷酸化EGFR表达水平的影响，发现只有卡瓦胡椒素A(Flavokawain A: FKA)可以显著抑制EGFR磷酸化，是一种潜在EGFR抑制剂，与本体系筛选结果一致。 （5）详细探究了卡瓦胡椒素A对A431细胞的抑制效应及作用机制。经FKA短时间(1h)和长时间(4h)处理后，磷酸化EGFR表达水平以及EGFR信号通路下游磷酸化Erk的表达水平都能显著下降，同时卡瓦胡椒素A能显著抑制A431细胞克隆形成和细胞迁移，并诱导A431细胞凋亡。 综上得出，本研究基于环境敏感策略成功的构建了一种特异靶向EGFR的小分子荧光探针，具有显著的基于EGFR的“off-on”响应特征，在细胞水平和动物水平对过表达的EGFR具有良好的靶向能力，为EGFR抑制剂筛选体系的建立提供了物质基础。基于EGFR抑制剂与探针分子竞争性结合EGFR后导致荧光信号强度减弱的原理，通过条件优化，建立了一种可在96孔板中操作的细胞水平的筛选体系，并成功的应用于食药资源来源的天然化合物的筛选，从40种食药资源来源的天然小分子化合物中筛选得到了一种来自食药源植物卡瓦胡椒的查尔酮类化合物卡瓦胡椒素A，经证实是一种潜在的EGFR抑制剂。本研究为从食品原料及食药同源资源来源的天然化合物中发现潜在EGFR抑制剂提供了一种新型技术手段。 |
| 并列题名： | Construction of “off-on” EGFR fluorescent probe and its application in the screening of food-medicine homologous active molecules eng |
| 题名主题： | 食药同源资源 EGFR 荧光探针 筛选 EGFR抑制剂 学位论文 |
| 中图分类： | TS201.2-533 |
| 个人名称等同： | 王丽霞 著 |
| 个人名称次要： | 王宣军指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240411 |