书目详细信息
： 二硫键异构酶在Notch1受体活化中的作用机理
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 二硫键异构酶在Notch1受体活化中的作用机理/.孙天柱著/.盛军指导 |
| 出版发行项： | 2022.6.8 |
| 载体形态项： | 109页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院,学号2019110003 |
| 提要文摘： | Notch受体广泛表达于后生动物细胞表面，在细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动中发挥重要作用。其紧密的负调节区域 (NRR) 如何打开，进而暴露能够被金属蛋白酶切割的S2位点是Notch活化的限速步骤，机理尚不清楚。NRR1晶体结构显示，位于HD-C端的二硫键断开可能是S2位点暴露的关键环节。提示蛋白二硫键异构酶 (PDI) 可能参与Notch的活化过程。Notch信号通路抑制剂（伽马分泌酶）的广泛作用对人肠道毒性太大，目前处于治疗瓶颈期。从天然产物中挖掘新型Notch1抑制剂具有重大意义。本论文首次证明了ERp5通过还原NRR1第10对二硫键导致NRR1的结构崩塌暴露出关键的S2位点从而促进Notch1活化。随后对普洱茶以及人参中的活性单体成分（鞣花酸、咖啡因、茶碱、黄嘌呤碱、原人参二醇以及原人参三醇）进行ERp5抑制剂的初步筛选，以期从这些天然产物中挖掘到新型的Notch1抑制剂。主要研究内容如下： 1．使用2种PDI抑制剂（DTNB和Bacitracin）处理HeLa细胞，结果显示DTNB和Bacitracin 都能够显著抑制EDTA诱导的Notch1活化。采用化学交联和免疫共沉淀方法证明了Notch1结合的PDI为ERp5。在HeLa细胞，敲低ERp5（sh-ERp5）能够抑制EDTA诱导的Notch1活化。在U937细胞，过表达ERp5或外源添加重组ERp5蛋白能够促进Notch1活化。以上结果证明了细胞膜表面ERp5对Notch1活化的必要性。 2. 通过分子克隆将NRR1与六聚组氨酸（6His）连接并克隆到分泌表达载体 PCS 中，成功在大肠杆菌以可溶的分泌方式表达和纯化出了重组NRR1蛋白。通过分子克隆将全长野生型ERp5以及2个催化基序片段（ERp5-F111和ERp5-F116）分别与6聚组氨酸（6His）连接并克隆到表达载体 pET28a 中，成功在大肠杆菌中表达和纯化出了可溶性的重组ERp5蛋白以及2个ERp5催化基序蛋白片段。将纯化的重组ERp5蛋白与重组NRR1蛋白进行室温共孵育，SDS-PAGE结果显示，在EDTA存在时，ERp5能够部分还原NRR1。进一步通过SPR技术，分子互作结果显示重组的ERp5蛋白与NRR1蛋白有直接的相互作用，其亲和力常数KD=0.735μM。然而在EDTA存在的情况下，EDTA降低了重组ERp5与NRR1蛋白亲和力常数（KD=1.7μM）。这些结果表明EDTA诱导NRR1的构像发生改变后，ERp5才能够部分还原NRR1。 3. 随后2个重组ERp5催化基序蛋白片段分别与重组NRR1蛋白孵育，结果显示在EDTA存在时，ERp5的2个催化基序都能够部分还原NRR1。进一步，通过分子克隆将全长突变型ERp5（M1和M2）分别与6聚组氨酸（6His）连接并克隆到表达载体 pET28a 中，成功在大肠杆菌中表达和纯化出了可溶性的重组ERp5-M1和ERp5-M2蛋白。随后2个重组突变ERp5蛋白分别与重组NRR1蛋白孵育，结果显示在EDTA存在时，2个重组突变ERp5蛋白仍然都能够部分还原NRR1。随后构建了真核表达突变的全长ERp5-M1 cDNA和ERp5-M2 cDNA，通过电转染的方法将2个重组质粒分别转入U937细胞，结果显示与空转染的细胞相比较，转染ERp5-M1 cDNA和ERp5-M2 cDNA的U937细胞膜表面ERp5表达量增加，相应的Notch1的活化水平也增加。接着在HeLa细胞上进行了同样的验证，通过流式细胞仪检测到2种细胞膜表面ERp5荧光增强，表明转染成功。进一步免疫印迹结果显示与空转染的HeLa细胞比较，转染后的ERp5-M1和ERp5-M2 HeLa细胞都能够促进Notch1活化。以上结果表明ERp5的2个催化基序都能够促进Notch1活化，与体外孵育结果相一致。 4. 通过分子克隆将NRR10（NRR1第10对二硫键突变（C-S），将其命名为NRR10）分别与六聚组氨酸（6His）连接并克隆到分泌表达载体 PCS 中，成功在大肠杆菌以可溶的分泌方式表达和纯化出了重组NRR10蛋白。重组ERp5蛋白分别与重组NRR1和NRR10蛋白孵育，结果显示在EDTA存在，ERp5能够部分还原NRR1而不能还原NRR10，表明ERp5作用于NRR1第10对二硫键，导致NRR1结构崩塌快速暴露S2位点促进Notch1活化。 5. 采用胰岛素浑浊实验在体外筛选了一些天然的小分子化合物，其中原人参二醇（PPD）和鞣花酸 (EA) 表现出ERp5抑制剂的潜力都能够抑制Notch1活化。进一步，与紫杉醇单独处理比较，EA和PPD分别与紫杉醇联合使用增加了α-Tubulin乙酰化水平显著抑制了HeLa细胞的增殖。以上结果表明EA和PPD能够抑制Notch1活化从而增强HeLa细胞对紫杉醇的敏感性。 综上所述，配体内吞作用以及EDTA螯合Ca2+只不过是ERp5还原NRR1第10对二硫键的触发条件，导致NRR1的结构完全展开暴露出关键的S2位点，从而促进Notch1受体活化。本研究可以为从天然产物中筛选和开发新型Notch1抑制剂提供理论基础以及对与 Notch1活化相关的各类疾病的治疗提供新的思路。 |
| 并列题名： | The mechanism of protein disulphide isomerase in Notch1 activation eng |
| 题名主题： | Notch1 二硫键异构酶 活化机制 天然产物 学位论文 |
| 中图分类： | Q71-533 |
| 个人名称等同： | 孙天柱 著 |
| 个人名称次要： | 盛军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20230522 |