书目详细信息
： 莲子心双苄基异喹啉类生物碱改善NASH的作用机制研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 莲子心双苄基异喹啉类生物碱改善NASH的作用机制研究/.王明月著/.王宣军指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.1 |
| 载体形态项： | 136页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2020110013 |
| 提要文摘： | 非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是诱发肝硬化和肝细胞癌的主要原因之一。由于NASH发病机制的复杂性致使目前无特效药物上市。近年来，天然植物的次级代谢产物因具有多样性的生物学效应成为多种疾病治疗药物的开发源泉，其中包括NASH。莲子是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera）的干燥成熟种子，具有药食两用价值，在民间可取其作为保肝护肝的滋补佳品。莲子心（Plumula Nelumbinis）是莲子中央的青绿色胚芽，味道苦涩，生物碱类是其主要的活性成分，主要含有莲心碱（liensinine，LIE）、异莲心碱（isoliensinine，IL）以及甲基莲心碱（neferine，NEF）等双苄基异喹啉类生物碱。其中，LIE具有改善非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）的作用，IL可改善肥胖小鼠胰岛素抵抗和血脂异常，NEF可降低药物引起的肝损伤；表明三个生物碱具有防治NASH的潜力。因此，本文旨在探讨三个莲子心双苄基异喹啉类生物碱调节NASH的作用及其作用机制。主要研究内容及结果如下： 1. NASH的病理特征为肝脏脂质沉积、小叶炎症及肝纤维化。因此，采用NASH的三种细胞模型即脂质沉积模型、炎性损伤模型以及纤维化模型探究三个莲子心双苄基异喹啉类生物碱针对NASH典型病理特征的作用效果。（1）通过油酸（oleic acid, OA）诱导HepG2细胞表现NASH脂质沉积的病理特征，OA处理可明显形成大量脂滴，表明模型构建成功；用12.5 μM和25 μM LIE、IL及NEF处理OA诱导的HepG2细胞24 h，结果表明三个生物碱可显著抑制肝细胞脂质沉积，主要表现为脂滴形成显著减少、细胞内TG含量降低、脂肪合成相关蛋白（FAS、SREBP-1C、PPARγ和SCD-1）与基因（SREBP-1C、FASN、PPARG）的表达下调，脂质分解相关蛋白（SIRT1和ATGL）与基因（PPARA、CPT1A和CD36）以及AMPK和ACC磷酸化水平上调。流式细胞术检测结果显示LIE、IL及NEF较OA组相比可显著抑制肝细胞凋亡，在12.5 μM浓度时，三个化合物的抗凋亡效果并不明显，但在25 μM浓度时凋亡率分别降低了58.4%、74%和43.2%，LIE、IL的抗凋亡效果优于NEF。（2）进一步在脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 预处理HepG2细胞构建的炎性损伤模型上探究三个化合物的体外抗炎作用，结果显示，经LIE、IL及NEF处理24 h后，与LPS组相比，可显著减少促炎相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase 1、IL-18、F4/80、Myd88、TLR4和p-P65）以及肿瘤坏死因子（TNF）-α基因表达量，表明LIE、IL与NEF可抑制肝细胞的炎症反应，其中LIE与IL的抗炎效果较强于NEF。（3）采用人肝星状细胞株LX-2细胞来探索三个生物碱对肝纤维化的影响。结果表明，与对照组相比，三个生物碱处理LX-2细胞24 h后，可明显下调Collagen Ⅰ、α-SMA与TGF-β蛋白与基因水平，并降低Smad2和Smad3的磷酸化水平，表明三个化合物可抑制肝纤维化的发生，其机制部分是通过抑制Smad2和Smad3磷酸化实现的，并且LIE、IL的抗肝星状细胞活性强于NEF。 2. 上述研究结果表明三个莲子心生物碱在体外可改善NASH的脂质沉积、炎症反应以及纤维化；为了验证其在动物体内具有同样的改善效应，选用高脂饮食饲喂C57BL/6小鼠联合腹腔注射四氯化碳复制NASH小鼠模型，连续4周腹腔注射给予LIE和IL（1 mg/kg/d、2 mg/kg/d）以及NEF（5 mg/kg/d、10 mg/kg/d），降低了模型小鼠肝重以及肝脏系数，减少血清中脂质（TG、TC和LDL-C）、炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和肝酶（ALT、AST）以及肝脏中TG、TC含量并增加肝HLD-C水平；其中在血清ALT和AST水平上NEF低剂量和高剂量组与模型组相比无统计学差异仅有改善趋势（p=0.066，p=0.064；p=0.497，p=0.19），而LIE、IL低剂量与高剂量组均具有统计学差异（p<0.05，p<0.01和p<0.001），表明LIE与IL改善肝损伤的作用效果优于NEF；并且在炎症因子分泌水平上的抑制效果也优于NEF。肝脏病理组织学结果显示，三个生物碱显著改善了模型小鼠肝脏脂肪变性、气球样变性、肝小叶炎症及纤维化程度，LIE、IL作用效果优于NEF。蛋白与基因水平检测结果表明，三个化合物可明显下调模型小鼠肝脏中脂质生成（FASN、SREBP-1C、PPARγ和SCD-1）、促炎（ASC、NLRP3、IL-18、IL-1β和TNF-α）以及纤维化（TGF-β1和α-SMA）相关蛋白与基因（Srebp-1c、Acc1、Fasn、Scd-1；Ccl2、F4/80、Tnf-α、Il-1b、Cxcl10；Col1a1、Col3a1、α-sma、Tgfb和Timp1）的表达，上调脂质分解（Atgl、Sirt1、Pparα和Cpt1α）相关基因的mRNA水平；以上结果显示三个生物碱从肝脂质沉积、小叶炎症以及纤维化方面阐释了对NASH模型小鼠的有效性，并通过以上检测结果发现LIE和IL在针对NASH中的炎症反应以及纤维化程度的改善效果上较NEF强，与体外结果一致。 3. 基于上述体内外研究结果表明三个生物碱具有改善NASH的效应，进一步探究其作用机制。X-盒结合蛋白1（X-box binding protein 1, XBP1）是内质网中调控细胞生长与分化的重要转录因子；XBP1s（spliced XBP1）是XBP1的剪接型，它通过调节细胞功能和激活脂肪酸合成酶的转录活性从而调节免疫系统、胰岛素、以及脂代谢，也可引起NASH小鼠炎症和肝损伤，是治疗NASH的潜在靶点。本文通过体内外检测结果发现LIE和IL可显著下调OA诱导的HepG2细胞以及NASH模型小鼠肝脏中XBP1s蛋白与基因水平，推测XBP1s是LIE和IL发挥改善NASH的潜在作用靶点。为了验证这一猜想，采用30 nM的XBP1抑制剂丰加霉素（Toyocamycin，Toy）预处理OA诱导的HepG2细胞，检测细胞内脂滴形成，TG含量、脂代谢与促炎相关蛋白以及基因水平变化，结果显示XBP1抑制剂Toy消除了LIE和IL对肝细胞中脂质沉积与炎症反应的抑制作用，提示LIE和IL是通过调控XBP1s从而发挥改善NASH的效应。然而，体内外实验结果均显示NEF对XBP1s蛋白表达量无明显抑制作用，推测NEF改善NASH的作用靶点不在XBP1s，可能是通过其他分子机制发挥作用。腺苷单磷酸活化激酶（AMPK）是调节代谢的重要因子，AMPK的激活可减弱NASH的进展。在OA诱导的HepG2细胞，免疫印记结果显示NEF可显著上调AMPK及其下游靶点ACC的磷酸化水平，推测NEF可能依赖于AMPK的激活发挥改善NASH的作用；进一步采用20 μM AMPK抑制剂Compound C（CC）以及10 μM AMPK激活剂AICAR预处理OA诱导的HepG2细胞，结果提示CC可逆转NEF在肝细胞中脂质沉积与炎症反应的抑制作用；而在AICAR作用下可驱动NEF在肝细胞中脂质沉积与炎症反应的抑制作用，以上结果表明NEF在NASH中的保护作用依赖于AMPK信号的激活。 综上所述，LIE、IL和NEF对NASH均有明显的改善作用，但LIE，IL的作用效果优于NEF并且作用机制不同。其中，LIE、IL可通过抑制XBP1s实现对NASH的改善作用，而NEF则是激活AMPK信号通路。表明食药同源的莲子心在NASH的预防和治疗过程中具有多靶点、多途径和多环节的协同作用，作用靶点的差异可能是由于三个生物碱的化学结构不同而导致其活性及作用机制异同，但具体构效关系还有待进一步探究。本研究为莲子心生物碱预防和治疗NASH提供了理论基础。 |
| 并列题名： | The ameliorative effect of bisbenzylisoquinoline from Plumula Nelumbinis on nonalcoholic steatohepatitis and its mechanisms eng |
| 题名主题： | LIE IL NEF NASH HepG2细胞 AMPK XBP1s 学位论文 |
| 中图分类： | R285-533 |
| 个人名称等同： | 王明月 著 |
| 个人名称次要： | 王宣军 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |