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猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是对养猪业影响最大的疫病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，建立快速、准确的分子检测技术对该病的早期诊断具有重要意义。装甲RNA是一种通过诱导细菌MS2噬菌体基因进行蛋白表达生成包裹有外源RNA片段的假病毒样颗粒的质控品技术，具有安全、稳定、耐核酸酶的特性。重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）是近年来开发的一种检测技术，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点。本研究通过制备PRRSV装甲RNA作为标准质控品，建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的实时荧光定量RPA（RT-qRPA）与RPA侧流层析试纸条（RPA-LFD）检测方法，并进行初步应用。主要研究结果如下：
（1）比对PRRSV相关基因序列，选择N基因保守序列片段作为装甲RNA标准品质粒的外源基因片段，通过合成质粒、酶切连接等方法成功制备了含有该片段的重组质粒，使用Nco I与Hind III进行双酶切以及Hind III单酶切验证，酶切位点切割的片段大小与预期相符；将重组质粒诱导表达后，SDS-PAGE检测出现14?kD蛋白条带，与预期相符，证明成功构建了重组质粒pET-28b-MS2-P（PRRSV）。通过稳定性和保存期实验表明，质控品经不同浓度DNase?I和RNase?A处理、37?℃下保存24h，-20?℃条件下保存3个月均能扩增出目的条带。
（2）选择和装甲RNA质粒中相应的基因片段，设计合成了2对RPA特异性引物和1个RPA-exo探针。使用反转录重组酶聚合酶等温扩增（RT-RPA）方法筛选获得1组实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法（RT-qRPA）最佳引物和探针组合，扩增目的片段为243?bp；在添加引物探针比1:1.5，反应温度41?℃时扩增效率最高，灵敏度实验表明对质控品检测的拷贝数下限为2.62×10¹?拷贝/μL，特异性实验显示该检测方法与临床样本中其他常见病毒核酸阳性模板无交叉反应。
（3）基于RT-qRPA方法的引物和探针，在下游引物5’端添加生物素标记以及调整探针的多标记位置，获得了RPA-nfo反应的特异性引物及相应探针，建立了RPA侧流层析试纸条（RPA-LFD）检测方法。灵敏度实验表明该检测方法的拷贝数下限为2.63×10¹?拷贝/μL，特异性实验显示该方法与临床样本中其他常见病毒的阳性模板无交叉反应。
（4）使用已建立的两种RPA检测方法与前期建立的RT-qPCR检测方法，对80份样品进行检测，结果表明：RT-qRPA、RPA-LFD、RT-qPCR?3种检测方法一致性达到100%，检测阳性率为6.3%。
综上所述，本研究成功构建了具有较好稳定性的PRRSV装甲RNA质控品，建立了PRRSV的RT-qRPA与RPA-LFD检测方法，与实验室已有的RT-qPCR方法检测结果具有较高的一致性，具备进行临床检测的可行性，为研发PRRSV快速检测试剂盒奠定了坚实的前期基础。