书目详细信息
： 葫芦素生物合成途径关键短链脱氢酶的半理性设计改造和催化机理研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 葫芦素生物合成途径关键短链脱氢酶的半理性设计改造和催化机理研究/.舒彦宇著/.杨生超，张广辉指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.25 |
| 载体形态项： | 100页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2020210173 |
| 提要文摘： | 葫芦科植物中富含葫芦素和其他三萜类化合物，葫芦素IIa属葫芦素F类化合物，是处方药物雪胆素片和雪胆素胶囊的主要成分。目前，本课题组已成功验证出葫芦二烯醇合酶、HcCYP87D20ase、HcCYP81Q58ase、HcCYP81Q59ase和HcSDRase，并且将葫芦科所有物种的SDRase进行了功能验证，确定18个SDRase都具有催化C-3羟基活性，其中HcSDRase催化活性最高。在葫芦素生物合成中CYP87D20ase和SDRase决定了葫芦素衍化方向，伴随着葫芦科物种在自然环境中的不断进化历程。 基于以上的研究基础，本研究进行了针对HcSDRase的催化活性改造和热稳定性改造，并通过酿酒酵母高效生产。参考最新的酶定向进化策略——半理性设计，对HcSDRase与底物进行多次分子对接，分析其催化空腔构成残基，通过进行丙氨酸扫描发现关键催化位点和潜在活性提升位点，而后单点饱和突变，结果显示出S153A为最佳活性提升突变体。针对在酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体产量提升问题，考虑通过提高HcSDRase热稳定性以延长酶在酵母体内的催化时间，以此提升酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体的产量。主要结果如下： 1．本实验验证了HcSDRase可催化多种底物（C-3羟基型葫芦素中间体），且骨架上的氧化修饰（羟基）越多，酶催化活性越强。 2．最佳单点饱和突变体S153A的催化转化数kcat为30.31，其Km相对于野生型HcSDRase减少了13.43%，与底物亲和力提升，整体催化效率kcat/Km为3.06×10-2 μm-1·s-1。 3．HcSDRase热稳定性改造的最佳单点突变体T170S，45℃水浴的半失活时间为61.59 min。组合突变体Tu，50℃水浴的半失活时间为449.73 min。 4．在酿酒酵母工程菌中验证结果表明，突变体Tu在工程菌中总产物产量在发酵过程中保持稳定上升趋势，在第14天检测结果为25.95 mg/L，且一直呈上升趋势。 5．通过对HcSDRase进行蛋白模拟和分子对接及结构分析，发现关键催化三联体（Ser154-Tyr167-Lys171）与底物C-3位点的距离决定了酶的催化效率；酶热稳定性提升的关键在于蛋白结构稳定，刚性结构增多，各相邻氨基酸残基之间的相互作用力增加，使得蛋白整体的结构刚性增强，解链所需能量更多。 综上所述，本研究进行了酶功能验证、催化活性改造和热稳定性改造，并且在酿酒酵母中验证体外酶突变结果。经过分析，推测得到HcSDRase的催化机理和酶热稳定性关键残基及其机制。验证出在体外提高HcSDRase催化四环三萜类化合物葫芦素中间体的效率可在酵母体内提升目的化合物的产量，且发现HcSDRase的底物偏好性，为进一步构建各类定向高产葫芦素中间体的工程菌提供了基础。为日后走向实际生产应用奠定基础。并且在分析HcSDRase的底物偏好性的过程中，为解析完整的葫芦素生物合成途径，以及了解在葫芦科植物漫长的物种分化过程中所伴随的葫芦素种类分化衍化与物种分布提供新思路。 |
| 并列题名： | Directed evolution and catalytic mechanism of short-chaindehydrogenases involving in cucurbitacin biosynthesis |
| 题名主题： | 葫芦素 短链脱氢酶 定向进化 催化活性 热稳定性 雪胆 学位论文 |
| 中图分类： | Q814-533 |
| 个人名称等同： | 舒彦宇 著 |
| 个人名称次要： | 杨生超 |
| 个人名称次要： | 张广辉 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |