书目详细信息
： 羊口疮内脏感染株和口唇感染株CBP基因序列及功能差异研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 羊口疮内脏感染株和口唇感染株CBP基因序列及功能差异研究/.曾琴著/.樊月圆，张冲指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.01 |
| 载体形态项： | 86页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210404 |
| 提要文摘： | 羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引发的一种高度接触性和嗜上皮性的人畜共患病，阻碍畜牧业发展，危害人类健康。ORFV与宿主长期互作，发展和进化出多重免疫逃避机制，涉及多个蛋白，ORFV 112基因编码的趋化因子结合蛋白（Chemokine Binding Protein，CBP）是其中之一。该蛋白主要在病毒感染早期发挥作用，能以高亲和力结合趋化因子表面受体，从而干扰宿主的免疫机制，增强ORFV的致病潜力。 在本研究中，通过基因克隆获得CBP基因序列并进行生物信息学分析；利用原核表达系统pGEX-4T-1诱导表达CBP蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体；采用便捷病毒载体系统（AdEasy Vector System，AdEasyTM）将CBP基因插入腺病毒骨架中，利用脂质体方式转染至HEK-293A细胞中进行包装病毒，通过双酶切、RT-PCR和Western Blot方法进行鉴定；采用TCID50测定重组腺病毒的滴度。以相同感染复数（MOI）的重组病毒感染羊外周血淋巴细胞，分别于4 h、8 h和12 h采用ELISA法测定各组细胞上清中游离趋化因子CCL-3、CCL-5和MIP-1的表达量，用RT-PCR方法检测淋巴细胞中IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ、TNF-α和STAT4的mRNA相对表达量。得到以下结果： （1）成功构建了克隆质粒pMD-19T-CBP-K、pMD-19T-CBP-N并获得了CBP CDS，测序结果显示，口唇感染株ORFV CBP全长873 bp，内脏感染株ORFV CBP全长846 bp，且在第217号位点有24 bp碱基的丢失；生物信息学分析显示，口唇感染株与内脏感染株不属于同一进化分支，遗传距离较远。口唇感染株CBP与中国吉林分离株NA17（序列号：MG764916）同源性最高，遗传距离最近；内脏感染株CBP与马来西亚分离株UPM/HSN-20（序列号：MW537048）同源性最高，遗传距离最近。口唇感染株CBP编码291个氨基酸，内脏感染株CBP编码282个氨基酸。 （2）构建的pGEX-4T-1-CBP-K、pGEX-4T-1-CBP-N原核表达质粒，用0.8 M IPTG在37 ℃，220 rpm/min诱导4 h，成功表达CBP融合蛋白，经尿素洗涤纯化后测定pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N融合蛋白溶液的质量浓度分别为1.5 mg/mL和2 mg/mL。用该纯化蛋白免疫小鼠，制备出鼠抗CBP多克隆抗体，其效价为1:400。 （3）构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-CBP-K、pAdTrack-CMV-CBP-N，采用细菌体内同源重组方法，分别将重组穿梭质粒插入到腺病毒骨架质粒中，获得重组质粒pAd Easy-CBP-K和pAd Easy-CBP-N。将其线性化后经脂质体介导转染至HEK 293A细胞，经6次扩增、纯化后，Western blotting检测pAd-CBP-K和pAd-CBP-N的外源基因CBP在HEK-293A细胞中表达，得到了与预期相符合的目的条带（60 kDa），测得pAd-CBP-K病毒滴度为3.35×107?pfu/mL，pAd-CBP-N病毒滴度为1.5×108 pfu/mL。 （4）用0.5 MOI重组腺病毒感染淋巴细胞，RT-PCR检测到CBP蛋白在淋巴细胞中成功表达，表达量与感染时间成正相关，而空载体腺病毒组无CBP的表达，说明重组腺病毒构建成功且在淋巴细胞中稳定表达，pAd-CBP-N组中CBP 表达量极显著高于pAd-CBP-K组（P＜0.01）。4 h、8 h和12 h的检测结果显示，pAd-CBP-K和pAd-CBP-N组均下调上清中游离趋化因子MIP-1、CCL-3和CCL-5表达量；均不同程度上调IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ、TNF-α和STAT4相对表达量；其中IL-2、IL-6和IFN-γ相对表达量差异性显著（P＜0.05）；IL-8、IFN-γ和STAT4相对表达量在8 h和12 h差异性显著（P＜0.05）。 综上所述，内脏感染株与口唇感染株相比，ORFV CBP基因序列有24 bp碱基的缺失，遗传关系较远。CBP通过调节游离趋化因子和相关细胞因子的表达量，能够激活下游信号STAT4，辅助增强CD4+T细胞的免疫应答，两毒株相比，前者的对机体的免疫调控的能力更显著。研究结果可为揭示CBP在ORFV与宿主互作中发挥的作用提供参考，也可为寻找新的羊口疮病防治方法提供依据。 |
| 并列题名： | Study on the difference of CBP gene sequence and function between Orf visceral infection strain and oral lip infection strain |
| 题名主题： | ORFV 趋化因子结合蛋白 重组腺病毒 免疫应答 学位论文 |
| 中图分类： | S855.3-533 |
| 个人名称等同： | 曾琴 著 |
| 个人名称次要： | 樊月圆 指导 |
| 个人名称次要： | 张冲 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |