草果为药食两用的草本植物,在市场上被大量应用,但草果产业存在一些种质资源混杂等问题。本研究利用SSR和DNA条形码分子标记技术对云南草果种质资源进行分析,旨在为草果遗传多样性研究奠定基础,为种质资源的划分和新品种的选育提供依据。试验采用正交试验设计,对草果SSR分子标记试验的PCR反应体系中的3个因素[DNA 模板(50 ng/μL)、2×Taq PCR StartMix、正反引物(10 μmol/μL)]进行优化,而后筛选引物,利用单因素分析法,对PCR退火温度及PCR扩增产物点样量进行试验与分析;采用SSR分子标记技术对24个草果居群进行分析;应用GenALEx、NTsys和Structure软件对数据进行分析处理,以分析其遗传多样性及亲缘关系。同时,以草果为样本对ITS、psbA-trnH、matK、rbcL和ycf1的DNA条形码常用序列进行筛选与评价,并对草果居群进行扩增,测序,测序序列用Genestar进行拼接,后用Mega进行数据处理,并对草果多样性及其鉴定进行分析和讨论。得出以下结果:(1)最终确定5个因素的最佳水平,即DNA 模板(50 ng/μL) 2 μL,2×Taq PCR StartMix 6 μL,正反引物(10 μmol/μL)各1.5 μL,dd H2O补足至20 μL (即加入ddH2O 9 μL),PCR产物点样量可以选择在1.5~2 μL之间。从48对SSR引物中筛选出了7对扩增结果好的引物。7个SSR引物可用于草果资源的遗传多样性研究,为草果及姜科植物分子技术研究提供科学依据。(2)24个草果居群的Shannon多样性指数(H)的平均数为0.49,期望杂合度(He)的平均数为0.32;遗传分化系数(Fst)为0.090,基因流(Nm)为2.930。24个草果居群的遗传分化有81%存在于居群内,仅有19%存在于居群间;黄花草果23个居群的遗传一致度(I)为0.6318-0.9824,遗传距离(D)的范围为0.0177-0.4592,而白花草果居群(MG5)与其他23个黄花草果居群一致度均较小,为0.3697-0.6090;从居群聚类分析得知,在遗传距离0.49处,明显地把白花草果与黄花草果分开;Structure聚类得出K=4时,209份黄花草果资源可被分为4个类群。云南黄花草果居群的遗传多样性水平平均偏高,遗传变异主要存在于居群内,而非居群间。根据基因型,黄花草果和白花草果被明显地划分成2类,遗传距离很远;而黄花草果大致被分为4个类群。(3)ycf1序列虽然无法将白花和黄花草果分开,但MG6的ycf1序列发现了序列位点的变异,为草果品种的选育做出贡献。ITS5、ITS4和ITS2F、ITS2R两对引物的扩增测序结果皆可将黄花和白花草果序列区分开,就变异位点而言,ITS2F、ITS3R对草果的扩增结果更优;草果matK和trnH-psbA两段序列的扩增成功率为0;草果白花黄花所有样本rbcL序列无任何变异,且用rbcL序列无法鉴别草果与其他同属植物。 |