书目详细信息
： 猪Septin12、Septin14相互作用蛋白的筛选及鉴定
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00(估)缴送 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 猪Septin12、Septin14相互作用蛋白的筛选及鉴定/.李罗刚著/.霍金龙指导 |
| 出版发行项： | 2019.6.5 |
| 载体形态项： | 80页:;+图表:;+30cm |
| 提要文摘： | 版纳微型猪近交系在生命科学领域具有重要的科研价值，但其群体数量一直难以有效扩大，主要是因为一些亚系的公猪不育所致。本研究以生精障碍关键候选基因Septin12、Septin14为研究对象，以版纳微型猪近交系典型不育的公猪为研究材料，使用酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）系统和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技术，分别筛选及验证与Septin12、Septin14蛋白相互作用的蛋白，为阐明版纳微型猪近交系生精障碍机理和调控网络提供理论依据。本研究在已获得基因Septin12和Septin14编码序列的基础之上，构建了pGBKT7-Septin12、pGBKT7-Septin14融合表达载体，并以此为诱饵，在猪睾丸cDNA文库中筛选与之互作的蛋白；构建了pGADT7-Septin12融合表达载体，通过免疫共沉淀技术验证筛选出的ETFA、LDHB蛋白与Septin12蛋白的互作关系，主要结果如下： 1.Septin12和Septin14蛋白质的生物信息学分析 Septin12基因CDS区长1092 bp，编码363个氨基酸，Septin14基因CDS区长1299 bp，编码432个氨基酸，生物信息学预测结果显示：Septin12基因的等电点为4.98，平均疏水性为0.961，不稳定系数为58.49，其二级结构中以无规则卷曲为主，占全部氨基酸序列的45.73%，Septin14基因的等电点为5.07，平均疏水性为0.791，不稳定系数为39.11，其二级结构中以α-螺旋为主，占全部氨基酸序列的50%，两者保守结构域中包含CDC_Septin超家族和P-loop_NTPase superfamily超家族。 2.成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Septin12、pGBKT7-Septin14 以睾丸组织cDNA为模板，扩增Septin12、Septin14基因，构建pGBKT7-Septin12、pGBKT7-Septin14诱饵载体，并对诱饵载体进行自激活和细胞毒性检测。结果表明诱饵载体对酵母菌无细胞毒性且自身无自激活现象。 3.构建了猪睾丸cDNA文库 利用RNAiso Plus试剂提取睾丸组织总RNA，再与载体pDNOR222连接（BP重组反应），转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞中制备初级文库菌液，从中抽提质粒后与载体pGADT7-DEST连接（LR重组反应）并转化至DH10B中制备次级文库菌液。通过缺陷型培养基SD/-Leu平板培养以鉴定文库质量，随机挑选单克隆进行PCR扩增以鉴定插入片段的长度和重组率。结果：初级文库总克隆数达到了1.6×107，次级文库总克隆数达到了8.0×106，分别从两个文库中随机挑选24个单克隆，进行PCR鉴定，结果表明，片段插入成功，重组率均为100%，平均插入片段长度均大于1 kb。本研究成功构建了酵母双杂交cDNA初级文库和次级文库，为进一步筛选与研究Septin12、Septin14的互作蛋白奠定了基础。 4.筛选出了与Septin12、Septin14相互作用蛋白 将pGBKT7-Septin12、pGBKT7-Septin14诱饵载体与次级文库杂交，通过逐级严格缺陷型培养基的筛选，经SD/-Ade-His-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA四缺型固体培养基筛选互作的蛋白。结果：在Septin12诱饵载体平板上筛选出50个阳性克隆，经测序及比对后确定为18种阳性质粒，将其分别与pGBKT7-Septin12诱饵质粒共转入Y2H Gold酵母感受态细胞，进行一对一互作验证，确定了14种与Septin12互作的蛋白，其中13个为已知蛋白（MRPS9、ETFA、CENP-L、GMCL1、WFS1、ATP1B3、Septin5、TOM1L1、LDHB、ENO1、E4F1、ATAD5、ZNF251），1个未知蛋白；在Septin14诱饵载体平板上筛选出2个阳性克隆，经测序和一对一互做验证后确定为1种蛋白ZNF251。 5.构建了免疫共沉淀验证载体pGADT7-Septin12，并验证了与Septin12互作的蛋白 构建pGADT7-Septin12载体，利用pGADT7载体上的HA标签进行免疫共沉淀实验。将pGADT7-Septin12载体导入猪睾丸细胞（Swine Testicle cell，ST）中，使用磁珠将与Septin12蛋白互做的蛋白共同沉淀下来。通过WB检测表明，Septin12蛋白与ETFA、LDHB蛋白之间存在相互作用。 |
| 并列题名： | Screening and Identification of proteins interacting with Porcine Septin12 and Septin14 |
| 题名主题： | Septin12基因 Septin14基因 酵母双杂交 免疫共沉淀 互作蛋白 学位论文 |
| 中图分类： | S828-533 |
| 个人名称等同： | 李罗刚 著 |
| 个人名称次要： | 霍金龙 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20200312 |