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： 牛朊蛋白基因（PRNP）不同单倍型之间差异表达基因的分子调控网络解析
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 牛朊蛋白基因（PRNP）不同单倍型之间差异表达基因的分子调控网络解析/.和晓明著/.邓卫东指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.23 |
| 载体形态项： | 176页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物科学技术学院, 学号2019110067 |
| 提要文摘： | 牛海绵状脑病（BSE）又称疯牛病，其主要病因是朊蛋白发生异常折叠并不断累积在脑部从而引起神经元和神经纤维出现异常变形和退化，最终引发牛行为和协调障碍并导致死亡，其高度传染性和致死性对牛产业和人类健康造成了重大威胁。朊蛋白由PRNP基因编码，被认为是BSE的主效基因之一，已有大量研究表明PRNP的变异与BSE易感性（抗性）增加高度关联，尤其是启动子中23bp和第一内含子上12bp的插入/缺失（Indel）与BSE的风险密切相关。然而，PRNP并不是唯一与BSE有关的基因，已有大量研究表明BSE的发生还可能受到其他基因的影响和调控，但基因指向不清晰。 为进一步系统全面筛选到提高BSE抗性、影响和控制BSE的新基因及其分子标记，降低BSE威胁并提高牛品质。我们首先巧妙地选择了大量集中屠宰且可以免费获取样品的迪庆牛为研究对象，在云南迪庆州香格里拉市采集了921头黄牛样品，分析其mtDNA和SRY基因序列后进一步遴选出655头迪庆牛，分析测定其PRNP基因23bp和12bp Indel多态；然后对迪庆牛PRNP基因23I-12I和23D-12D这2种单倍型的各12个延髓样品开展了mRNA和miRNA测序，构建与解析这2种不同单倍型的mRNA和miRNA分子调控网络；最后对筛选到的关键基因以斑马鱼为模式动物采用CRISPR/Cas9技术开展基因敲除等功能验证，主要结果如下： 1. 迪庆牛鉴定及其PRNP基因多态性分析 检测了921头黄牛的mtDNA D-loop区，构建邻接（NJ）进化树筛选出655头迪庆牛，对其中的591头公牛克隆了SRY基因编码区并绘制中介网络图，筛选同一父系起源的迪庆牛。然后鉴定了迪庆牛PRNP基因的23bp和12bp Indel多态性，23bp Indel基因型频率分别为0.162（I/I）、0.586（I/D）和0.252（D/D），等位基因频率为0.455（I）和0.545（D）；12bp Indel基因型频率为0.656（I/I）、0.305（I/D）和0.038（D/D），等位基因频率为0.809（I）和0.191（D）；23I-12I、23D-12D、23I-12D和23D-12I单倍型频率分别为0.433、0.168、0.022和0.377，发现这4种单倍型特别是23I-12I和23D-12D相对均衡，特别适合下一步研究开展。 2. PRNP基因不同单倍型下mRNA和miRNA分子调控网络的构建与解析 挑选了性别和年龄均一的23I-12I和23D-12D两个单倍型的迪庆牛各12头，对其延髓样品进行mRNA和miRNA测序，mRNA测序共获得23,031个表达基因，108个属于差异表达基因，其中，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（CDKN2B）、核氧化还原蛋白样蛋白2（NXNL2）、趋化因子CXC配体13（CXCL13）等50个基因上调；环核苷酸门控阳离子通道蛋白CNG-1β（CNGB1）、载脂蛋白B-mRNA编辑酶复合物2（APOBEC2）和磷酸二酯酶1C（PDE1C）等58个基因下调。miRNA测序鉴定出42个差异miRNAs，其中bta-miR-1246、bta-miR-196b、bta-miR-211等24个上调；bta-miR-122、bta-miR-219、bta-miR-2316等18个下调。此外，mRNA-miRNA联合分析发现42个差异miRNA在TargetScan、miRWalk两个数据库中共预测出18647个靶向基因，随后将这些靶向基因与转录组测序获得的108个差异表达基因进一步开展分析，发现APOBEC2、PDE1C、PCDH19等52个差异表达基因与bta-miR-122、bta-miR-211等12个差异表达miRNAs存在靶向关系。 以PRNP基因为基础构建了差异表达基因之间的蛋白互作网络（PPI），采用最大团中心性（MCC）、最大领域分量密度（DMNC）和最大领域分量（MNC）等5种算法，筛选到肌球蛋白重链2（MYH2）、原钙粘蛋白19（PCDH19）、肌球蛋白轻链2（MYL2）、转化受体电位阳离子通道亚家族V成员6（TRPV6）、瘦素受体（LEPR）、驱动蛋白家族成员12（KIF12）、CDKN2B、C型凝集素结构域家族5成员A（CLEC5A）、环核苷酸门控阳离子通道1β（CNGB1）和动力蛋白轴丝重链11（DNAH11）这10个候选基因；进一步使用机器学习算法缩小并锚定到PCDH19、MYL2、TRPV6、LEPR、CDKN2B、CNGB1、DNAH11这7个关键基因；随后构建了这7个关键基因与牛转录因子（TFs）的共表达调控网络，开展了这7个关键基因与剩余的101个差异表达基因单基因的基因集富集分析（GSEA）及GO和 KEGG富集，发现在TF-mRNA调控网络中PCDH19基因具有最多转录因子结合位点且高达74个，并富集到751个GO术语和79条KEGG通路，还关联到帕金森病相关的通路；最后发现在23D-12D单倍型组内，PCDH19正向调控了PRNP，相关系数为0.43，但二者的表达量差异显著（P<0.05），表明PCDH19可能作为PRNP不同单倍型内分子调控网络的核心基因。 3. 抗BSE相关新基因的分子克隆及功能验证 通过实时荧光定量PCR测定8个差异表达基因（PRNP、APOBEC2、PCDH19、PDE1C、DCX、BNC2、BCO2和OR9Q2）和5个差异表达miRNA（bta-miR-2316、bta-miR-211、bta-miR-449a、bta-miR-196b和bta-miR-122）的表达量，对比mRNA和miRNA测序结果均得到了相同的表达趋势。利用双荧光素酶报告基因的靶向试验证实了bta-miR-196b、bta-miR-2368-3p负调控PRNP，bta-miR-196b负调控PCDH19，bta-miR-122、bta-miR-499a负调控APOBEC2，bta-miR-211负调控PDE1C，过表达的miRNA能够靶向抑制目标基因的表达。为进一步确认PCDH19的功能，我们挑选了PRNP基因中23I-12I和23D-12D单倍型的各52个样本（已包含上述各12个转录组测序样本），克隆了PCDH19基因5’调控区约2300bp序列，找到了6个SNPs位点，分别为-1597A>G、-1495G>T、-1415C>G、-923A>C、-855C>T和-176C>T，它们构成了12个单倍型，其中，GTCACC在2组中为优势单倍型（23I-12I组中频率为0.297，12D-23D组中频率为0.338），单倍型AGCACT的频率在23I-12I组中为0.150，在12D-23D组中为0.047，单倍型AGGATC频率在23I-12I组中为0.058，12D-23D组中为0.0001，频率均差异显著（P<0.05）。 最后我们使用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼pcdh19基因5’调控区1400bp片段，观测斑马鱼胚胎受精后20小时（hpf）、30 hpf、48 hpf和72 hpf时间段的脑部发育状况并检测相关基因表达量，结果显示基因敲除成功并获得杂合突变体pcdh19+/-，与野生组相比，各时期的pcdh19基因mRNA表达均下调，其中20 hpf和72 hpf差异不显著（P>0.05），但30 hpf（P<0.01）和48 hpf（P<0.05）差异显著。同时对7个关键基因（PRNP（PRNPa和PRNPb）、MYL2a、TRPV6、LEPR、CDKN2B、CNGB1a、DNAH11）进行了qRT-PCR验证，发现它们在不同发育时期的表达量均存在差异，特别是cdkn2b基因在上述4个时期均在敲除后高表达且差异极显著（P<0.01）；此外，敲除pcdh19基因的斑马鱼在胚胎发育早期（30 hpf），其大脑前神经板区出现了形态破坏，再次证实了pcdh19基因在前神经板的正常发育和形态维持中具有重要作用。 综上所述，本文首次以牛PRNP基因不同单倍型为组别，进行了mRNA和miRNA测序，构建了以PRNP基因为基础的分子调控网络，筛选出可能与BSE相关的PCDH19、MYL2、TRPV6、LEPR、CDKN2B、CNGB1和DNAH11 这7个基因和bta-miR-219、bta-miR-2316、bta-miR-211等8个miRNAs，随后通过双荧光素酶报告基因技术和CRISPR/Cas9技术进一步发现PCDH19基因极有可能参与黄牛BSE的调控。总之，本文系统全面发掘了影响BSE的基因，获得了可能在BSE中起关键作用的新基因，该结果对降低潜在的BSE威胁和提高牛品质具有重要的理论意义和实践价值。 |
| 并列题名： | Analysis of the Molecular Regulatory Network of Differentially Expressed Genes between Different Haplotypes of the Bovine Prion Protein Gene (PRNP) eng |
| 题名主题： | 疯牛病 单倍型 转录组测序 miRNA测序 分子调控网络 基因敲除 学位论文 |
| 中图分类： | S813.1-533 |
| 个人名称等同： | 和晓明 著 |
| 个人名称次要： | 邓卫东 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |