候选基因的筛选与分析 基于月亮谷纯系抗(L2)、感(L3)受稻瘟病菌侵染早期转录组数据,利用WGCNA构建加权基因共表达网络,从抗病纯系中筛选出11个抗稻瘟病候选基因。通过生物信息学软件对候选基因进行了分析。利用实时荧光定量PCR技术对这些候选基因进行表达分析,结果表明BGIOSGA023826、BGIOSGA016507均受到M. oryzae诱导表达,并将它们分别命名为候选基因BRG23826(Blast Resisitence Gene 23826)和BRG16507(Blast Resisitence Gene 23826)。PCR扩增获得上述2个候选基因的全长并进行测序,使用DNAMAN拼接其完整序列,对抗、感纯系和日本晴进行多序列比对。
以‘月亮谷’抗病纯系L2为序列供体扩增候选基因的全长CDS,构建2个候选基因过表达载体,并对日本晴进行遗传转化,对过表达植株进行表型测定,结果表明转基因植株对稻瘟病的抗性提高。
时空表达模式分析显示,两个候选基因在水稻叶片中表达量最高,候选基因BRG3826在孕穗期叶片中相对表达量最高,BRG16507基因在水稻分蘖期叶片相对表达量最高。两个候选基因在四个生长期都有表达,说明筛选出的这两个候选基因可能参与了水稻生长发育的整个过程。
以转基因植株BRG23826、BRG16507、日本晴为材料,通过实时荧光定量 PCR 技术分析水稻抗性反应相关基因PR1b、PBZ1、OsNPR1、WRKY45、和Os AOS2的相对表达量变化趋势。PBZ1基因表达量显著上调;PR1b基因在接种后 12h表达量持续上调;转录因子WRKY45 在接种前后显著上调近20倍;JA途径的关键基因OsAOS2 表达量在接种稻瘟菌后12h表现出显著上调的现象。
对转基因材料的SA、JA激素含量进行测定,茉莉酸含量在接种后12h含量升高,而水杨酸含量在接种后24h含量才呈现上升趋势,证明在水稻-稻瘟菌互作的早期反应中,茉莉酸比水杨酸更早发挥作用。
对转基因植株SOD含量、ROS含量、MDA活性进行测定,结果显示SOD含量变化不明显,接种后ROS含量分别在12h、36h出现两次突增,当活性氧第二次突增时MDA活性也同时增长。