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： 葡萄酒石酸生物合成关键酶VvTK基因克隆与功能分析
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 葡萄酒石酸生物合成关键酶VvTK基因克隆与功能分析/.于坤淼著/.马春花,邵建辉指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.08 |
| 载体形态项： | 50页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 园林园艺学院, 学号2020210181 |
| 提要文摘： | 葡萄（Vitis vinifera L.）具有较高的经济和营养价值，然而全球变暖使酿酒葡萄中部分有机酸降解引起葡萄果实酸度偏低，影响葡萄酒的感官品质。酒石酸（Tartaric acid，TA）是葡萄的特征酸，是成熟葡萄和葡萄酒酸度的最重要贡献者。转酮醇酶（Transketolase，TK）可以催化5-酮-D-葡萄糖酸（5-Keto-D-gluconic acid，5-KGA）生成酒石酸半醛进一步生成TA，为深入研究TK在TA生物合成中作用，本课题组前期通过不同TA积累型酿酒葡萄比较转录组分析，筛选到大量差异表达基因，分离到了TK差异候选基因VvTK（VIT_15s0048g00370），本试验拟通过生信分析，载体构建，葡萄果实瞬时转化与番茄异源遗传转化分析TK差异候选基因VvTK在TA生物合成中的作用，分析结果如下： （1）VvTK编码区（CDS）长度为2238 bp，745个氨基酸；蛋白质分子式C3576H5630N1000O1077S25；蛋白分子量分别80.67 kD；理论等电点（pI）分别为6.62；VvTK是存在跨膜螺旋结构的非分泌性蛋白。通过同源序列和系统进化树分析，发现‘马瑟兰’葡萄的VvTK与甜瓜、冬瓜，蓖麻等物种相似性较高到达80%以上；VvTK与同一亚纲的常绿越橘和中华猕猴桃在遗传关系上极为接近。以Q-PCR检测酿酒葡萄‘马瑟兰’，不同发育时期基因表达及TA含量，结果表明不同发育时期‘马瑟兰’葡萄果实中的VvTK基因相对表达量呈下降趋势，在成熟期下降最多，达到90.97%。TA含量在转色期到成熟期酒石酸含量下降了34.81%，通过相关性分析VvTK基因表达量与TA含量呈正相关。推测VvTK基因可能在TA生物合成中起正向作用。 （2）根据课题组前期完成的转录组拼接序列和CDS预测序列，设计带有同源臂的引物，并成功克隆出TA生物合成关键酶基因VvTK，利用无缝克隆技术将目的基因重组到线性化的载体pCAMBIA1300和pCAMBIA1301。将重组载体转入大肠杆菌，并验证菌液，成功构建了pCAMBIA1300::VvTK和pCAMBIA1301::VvTK植物表达载体。构建好的的载体导入根癌农杆菌GV3101，菌液验证后，成功获得了农杆菌工程菌株。 （3）以‘巨峰’葡萄果实为试验材料，通过农杆菌介导法进行侵染，结果表明过表达VvTK基因后，其与对照相比基因表达量在2 d、4 d、8 d时显著增高，分别增加了62.03%、92.88%、72.13%。过表达VvTK基因的葡萄果实TA含量在第2 d、6 d、8 d、10 d显著高于对照，分别提高了27.61%、30.45%、21.60%、12.62%，且相关性分析结果表明VvTK基因表达量与TA含量为正相关。这表明VvTK可能参与了葡萄TA生物合成。 （4）克隆VvTK基因全长，构建pCAMBIA1301表达载体，通过农杆菌介导法，获得含目的转基因番茄苗。提取13株番茄叶片中的DNA，进行PCR检测，8株可以检测到目的基因片段，说明VvTK基因已经整合到这8个株系的基因组中。对经过PCR检测的阳性株系进行RT-PCR扩增，3个株系扩增出目的基因，表明VvTK转基因株系中能够顺利转录，获得3个转基因株系。对转基因株系的绿熟期，破色期果实以及红熟期果实进行表达分析，结果表明在转基因番茄植株中，随着果实的发育，VvTK基因表达量先升高后降低，其中破色期番茄果实基因表达量达到最高，比野生型破色期果实高2467.63倍，番茄果实在成熟过程中基因表达量先升高后降低，红熟期果实比野生型红熟期果实升高了353.13倍。通过对转基因番茄果实TA含量检测，番茄果实在破色期TA含量最高，是野生型TA含量的1.44倍，在不同时期TA含量呈先上升后下降趋势，与基因相对表达量变化趋势相一致。通过相关性分析推测，在遗传转化番茄果实中，VvTK基因表达量与TA含量正相关，与瞬时表达结果相一致。 （5）通过对番茄植株表型观察发现，转VvTK基因番茄植株形态发生变化。表现为：转VvTK基因植株常瘦弱，矮小，整个植株呈披垂状，比野生型番茄植株叶片小。另外，转VvTK基因植株叶片较正常番茄植株叶片厚，叶片呈深绿色。这些结果表明，VvTK基因可能抑制了番茄植株的生长发育。 |
| 并列题名： | Cloning and functional analysis of VvTK gene, a key enzyme in biosynthesis of tartric acid |
| 题名主题： | 葡萄 酒石酸 转酮醇酶 功能验证 学位论文 |
| 中图分类： | S663.1-533 |
| 个人名称等同： | 于坤淼 著 |
| 个人名称次要： | 马春花 指导 |
| 个人名称次要： | 邵建辉 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |