书目详细信息
： 不同转染条件下基因编辑阳性猪成纤维细胞的筛选及验证
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 不同转染条件下基因编辑阳性猪成纤维细胞的筛选及验证/.张一凡著/.魏红江指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.25 |
| 载体形态项： | 55页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物科学技术学院, 学号2020210348 |
| 提要文摘： | 基因编辑结合体细胞核移植技术是目前生产基因编辑猪的主要方式，转染获取高效率的基因编辑供体细胞是高效生产基因编辑克隆猪的前提。在猪的体细胞核移植中，由于胚胎干细胞培养技术尚不成熟，因此常用的供体细胞是成纤维细胞。成纤维细胞属于成体细胞，在多次的转染和长期筛选过程中容易老化，影响基因编辑的效率。因此，需对转染过程进行优化缩短培养周期来提高基因编辑效率。目前，基因编辑细胞转染的主要方法有慢病毒转染、脂质体转染、电穿孔转染等。电穿孔法操作简易快速、毒性低、转染效率高等优点使其较为常用，但是电穿孔转染可应用的设备较多，不同设备与转染条件的转染效率和对靶细胞的影响尚不清楚。因此，本研究针对细胞转染中常用的电转染参数进行筛选，并对其对靶细胞的影响进行探索研究。 本研究通过流式细胞仪对细胞在20%、40%、60%、80%、100%汇合度下的细胞周期进行检测，选择转染最佳细胞转染汇合度，对比2000ng、4000ng、6000ng质粒用量转染后的细胞形态、存活率、荧光强度，筛选最佳质粒用量。对处于最佳汇合度下的猪胎儿成纤维细胞用最佳质粒转染量对Leptin、CMV-GFP过表达质粒与CMAH、GGTA1基因敲除质粒在LONZA转染仪的L1（EH-100）、L2（CM-137）、L3（EN-150），Neon转染仪的N1（1450V，10ms，3）、N2（1650V，10ms，3）和N3（1750V，10ms，3）六组电转染条件下进行转染，显微观察对比转染后细胞状态，台盼蓝染色计算细胞存活率，流式细胞仪分析转染效率，分选细胞测序验证基因编辑效率。对比不同转染条件下细胞凋亡、衰老以及增殖情况。在最佳转染条件和质粒用量下，用GGTA1基因敲除质粒对猪胎儿成纤维细胞进行转染，通过极度稀释培养，对克隆点测序验证后，挑选其中一个克隆点进行体细胞核移植及胚胎移植，选取基因修饰成功的胎儿细胞再次进行体细胞核移植及胚胎移植，对获得的胎儿和仔猪进行PCR鉴定和Sanger测序检测基因型。 结果显示，当细胞处于60%汇合度时,细胞分裂旺盛，为电转染的最佳汇合度，当质粒用量为2000ng时，转染细胞的存活率与效率最高（P＜0.01）。在六组转染条件转染过表达与敲除质粒后，细胞形态均未发生明显变化，敲除质粒转染后存活率为：L1＞N2＞L3＞L2＞N3＞N1（P＜0.05），过表达质粒转染后存活率为：L1＞L3＞L2＞N3＞N1＞N2（P＜0.05）；敲除质粒转染后荧光率为：N2＞N3＞L1＞N1＞L3＞L2（P＜0.05），过表达质粒转染后荧光率为：N3＞N1＞L1＞N2＞L3＞L2（P＜0.05）；二者均得到目的基因序列，T7EN1酶切最佳效率为L1；转入敲除质粒细胞凋亡率：L1＞N2（P＜0.01），转入过表达质粒细胞凋亡率：N3＞L1（P＜0.01）；转入敲除质粒细胞增殖：N2＞L1（P＜0.01），转入过表达质粒细胞增殖：L1＞N3（P＜0.01）；在不同电转染条件中细胞衰老无显著差异。GGTA1基因敲除质粒转染后经过极度稀释培养，共得到59个细胞克隆点，其中8个克隆点中GGTA1基因均发生敲除。选基因型最纯的48号克隆点进行体细胞核移植和胚胎移植。代孕母猪妊娠33天时通过外科手术获得14个胎儿，其中F09、F10、F13和F14胎儿的GGTA1基因型与48号克隆点完全一致，均敲除2bp。流式细胞仪分析结果显示，四个胎儿的GGTA1基因在成纤维细胞中几乎不表达；以F10和F13胎儿的成纤维细胞作为供体细胞所获得的16头仔猪基因型与胎儿一致，均敲除2bp，因此我们成功的获得了GGTA1基因敲除胎儿与仔猪。 综上所述，本研究表明，最佳的细胞转染汇合度为60%，电转染最佳质粒用量为2000ng，针对敲除质粒的最佳转染条件为LONZA转染仪L1（EH-100）转染条件，过表达质粒的最佳转染条件为Neon转染仪的N3（1750V，10ms，3）转染条件，当细胞转染效率较高时，会诱导细胞凋亡，但不会影响细胞增殖与细胞衰老。而且本研究应用L1（EH-100）转染条件成功获得GGTA1基因敲除克隆猪，为高效制备基因编辑猪奠定基础。 |
| 并列题名： | Screening and validation of gene edited positive porcine fibroblasts under different transfection conditions |
| 题名主题： | 电转染 猪胎儿成纤维细胞 基因编辑 GGTA1 学位论文 |
| 中图分类： | S813.3-533 |
| 个人名称等同： | 张一凡 著 |
| 个人名称次要： | 魏红江 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |