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： 三七素生物合成途径解析及体外合成研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 三七素生物合成途径解析及体外合成研究/.刘启泽著/.张广辉指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.12 |
| 载体形态项： | 72页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2020210123 |
| 提要文摘： | 三七素是药用植物三七（Panax notoginseng）中的一类非蛋白氨基酸，是三七止血活性的主要成分，还具有治疗糖尿病肾病并发症、抗炎、降血糖等多种药理活性。随着合成生物学的发展，越来越多重要药物化合物的天然合成途径被解析，并运用合成生物学技术实现药物单体的异源合成，然而三七素的天然合成途径尚未解析，主要来源于植物提取，限制了三七素生物合成技术的开发。 课题组前期的研究中提出了三七素生物合成途径假设，磷酸吡哆醛依赖性酶（PALP）催化磷酸丝氨酸和L-谷氨酸产生中间体N-（1-氨基-1-羧基-乙基）-谷氨酸，中间体被鸟氨酸环脱氨酶（OCD）进一步催化形成L-2,3-二氨基丙酸（L-DAP），酰基激活酶（AAE）催化草酸和辅酶A形成草酰辅酶A，随后酰基转移酶（BAHD）催化L-DAP和草酰辅酶A（Oxalyl-CoA）形成三七素。根据转录组数据，结合生物信息学分析，确定了参与三七素合成途径的4条PnPALP、1条PnOCD、5条PnBAHD和1条PnAAE，本文在前期研究的基础上，以三七为材料，对合成途径中的候选基因进行原核表达及功能鉴定；其次，为开发一条高效的三七素合成方案，设计了一条人工合成途径，运用蛋白质数据库进行酶的筛选；最后，采用体外合成技术实现了由L-DAP到三七素的初步合成，本研究旨在为三七素的合成途径解析以及生物合成技术的开发提供参考，主要结果如下： （1）克隆获得了所有候选基因，包括4条PnPALP、1条PnOCD、5条PnBAHD、1条PnAAE，以pet-28a为表达载体将这些基因成功在大肠杆菌中进行表达， PnOCD和PnBAHD31重组蛋白大多形成了包涵体，而在三七中仅发现一条PnOCD，随后融合MBP蛋白标签改善了PnOCD的表达情况。 （2）PnPALP和PnOCD的体外酶活验证中，尚未检测到产物L-DAP的产生，因此构建了本氏烟草稳定转化体系，PnOCD成功在本氏烟草中稳定表达，为后续PnPALP和PnOCD两类基因在本氏烟草体系中的验证提供基础。成功验证了PnAAE7催化草酸和辅酶A产生Oxalyl-CoA的功能，验证PnBAHD的功能时，发现了L-DAP和Oxalyl-CoA在体外反应中可自发产生三七素。 （3）在人工合成途径中，三七素的合成由三步反应完成，第一步由L-丝氨酸氧化脱氢形成3-氧代-丙氨酸（3-oxo-alanine），第二步3-oxo-alanine被还原胺化形成L-DAP，第三步由L-DAP和草酸在酰胺合成酶的作用下形成三七素。本文在数据库中查找得到丝氨酸氧化脱氢酶、还原胺化酶和酰胺合成酶的同源蛋白共22个，构建了重组载体并进行了蛋白表达与纯化，结果除ydfG和rutE外，所有候选基因都获得了可溶性蛋白；在体外酶活实验中成功验证了第一步反应中ydfG和pydE催化L-丝氨酸氧化生成3-oxo-alanine的功能。 （4）为实现三七素的初步合成，构建了由前体L-DAP和酶法产生Oxalyl-CoA来合成三七素的方法，同时使用两种方案来合成Oxalyl-CoA，方案I由磷酸乙酰基转移酶（pta）催化乙酰磷酸和CoA产生乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），再由乙酰辅酶A-草酸辅酶A转移酶（yfdE）催化Acetyl-CoA和草酸产生Oxalyl-CoA；方案II由酰基激活酶（AAE）催化草酸和CoA产生Oxalyl-CoA；通过反应条件的优化，方案I的最优反应pH为9.0，温度为44 ℃，酶比例pta：yfdE=1:1，草酸浓度为25 mM，该条件下在100 μL体系中产生0.655 mM三七素；方案II的最优反应pH为11.0，温度为52 ℃，在100 μL体系中产生1.233 mM三七素。为了进一步提升三七素积累量，本文在反应体系中加入了LsBAHD3，LsBAHD3是山黧豆（Lathyrus sativus L.）中已鉴定催化三七素最后一步合成反应的酶。最终在50 mM HEPES缓冲溶液（200 mM NaCl，5 mM MgCl2，pH=11.0）、5 mM L-DAP、5 mM 草酸、2.5 mM CoA、5 mM ATP、、3 g/L LsBAHD3的100 μL体系中，最终可产生三七素的最高含量为3.105 mM。 |
| 并列题名： | Study on the biosynthetic pathway and in vitro synthesis of dencichine |
| 题名主题： | 三七素 L-2 3-二氨基丙酸 原核表达 体外合成 学位论文 |
| 中图分类： | S567.236-533 |
| 个人名称等同： | 刘启泽 著 |
| 个人名称次要： | 张广辉 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |