书目详细信息
： 云南荷斯坦牛隐孢子虫分布特征及RAA检测方法的建立
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 云南荷斯坦牛隐孢子虫分布特征及RAA检测方法的建立/.衡昭君著/.杨建发，邹丰才指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.26 |
| 载体形态项： | 75页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2020210426 |
| 提要文摘： | 隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）是重要的人兽共患原虫，感染隐孢子虫的牛是人隐孢子虫病的重要传染源。云南牛种质资源丰富，其中荷斯坦牛是云南地区主要养殖的奶牛，有潜在感染隐孢子虫的风险。然而，目前对云南荷斯坦牛中隐孢子虫的分布规律及遗传特征尚不清楚。为此，本论文调查了云南荷斯坦牛隐孢子虫的分布规律、亚型多样性，并建立隐孢子虫快速检测方法，为荷斯坦牛养殖提供参考数据以及防控建议。 本研究自大理州、昆明市、曲靖市和楚雄州4个地区随机采集616份荷斯坦牛新鲜粪便，提取全部样品的粪样DNA，采用巢氏PCR扩增隐孢子虫SSU rRNA基因结合DNA测序进行隐孢子虫的检测、虫种鉴定，并使用SPSS 20.0等统计软件计算P值、95%置信区间（confidence interval，CI）和比值比（odds ratio，OR）。结果显示：荷斯坦牛体内隐孢子虫的总体感染率为23.54%（145/616）。不同地区、采样地点和年龄等因素会增加荷斯坦牛感染隐孢子虫的风险，隐孢子虫的感染与这些因素具有极显著相关性（P＜0.01），性别因素和荷斯坦牛感染隐孢子虫有相关性（0.05＞P＞0.01）。BLAST在线比对显示，本研究检出的145份隐孢子虫中，包括93份牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis）、26份芮氏隐孢子虫（Cryptosporidium ryanae）、24份微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和2份安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）虫种感染。C. bovis在不同地区、性别和年龄段的荷斯坦牛中均为优势流行虫种。 采用巢氏PCR结合DNA测序方法对检出的隐孢子虫种进行基因亚型的鉴定。通过gp60（60 kDa glycoprotein gene）基因位点分别扩增C. parvum、C. bovis和C. ryanae的基因亚型，其中C. parvum共鉴定出IIdA18G1（9/13）、IIdA19G1（4/13）2种基因亚型，IIdA18G1为优势基因亚型；C. bovis共鉴定出XXVIe（19/51）、XXVIa（5/51）、XXVIc（3/51）、XXVIb（13/51）、XXVIf（8/51）、XXVId（3/51）6种基因亚型，其中XXVIe为优势基因亚型；C. ryanae共鉴定出XXId（1/6）、XXIg（2/6）、XXIf（1/6）、XXIe（1/6）、XXIa（1/6）5种基因亚型。 为建立快速检测以上4种隐孢子虫的重组酶介导的核酸等温扩增（Recombinase-aided isothermal amplification，RAA）实验方法，本研究设计了4对引物，分别从温度、引物的量和乙酸镁I的量优化了最佳反应条件，并对该方法的特异性和灵敏性进行验证。实验结果表明：建立的4个单一RAA反应最佳温度均为37℃，最佳引物用量均为3 µL，即反应浓度为0.6 μmol/L，最佳乙酸镁I用量均为3 µL，即反应浓度为16.8 mmol/L；特异性实验表明，该RAA方法只能识别出对应的隐孢子虫种，与毕氏肠微孢子虫、十二指肠贾第鞭毛虫、弓形虫、球虫、毛细线虫、蛔虫基因组DNA无交叉反应；敏感性实验表明，检测C. parvum灵敏度可达102个质粒拷贝，检测C. andersoni、C. bovis、C. ryanae灵敏度均可达103个质粒拷贝。本研究进一步建立了可在40 min内特异性扩增C. andersoni和C. parvum目的基因片段的重组酶介导的多重核酸等温扩增方法（Multiple recombinase-aided isothermal amplification，mRAA）。确定最佳反应温度为37℃，C. andersoni和C. parvum上、下游引物最佳用量分别为1 µL（反应浓度为0.2 μmol/L）和1.75 µL（反应浓度为0.35 μmol/L），乙酸镁I最佳用量为3 µL，即反应浓度为16.8 mmol/L，最低可以检测出103个质粒拷贝，且只能检出各自特异性条带。 本研究获悉了云南荷斯坦牛隐孢子虫的分布特征，此外还建立了C. andersoni、C. parvum、C. bovis和C. ryanae 4种隐孢子虫的单一RAA检测方法以及C. andersoni和C. parvum的多重RAA快速检测方法，为云南荷斯坦牛隐孢子虫感染防控提供了理论数据，也为隐孢子虫快速鉴别和检测提供了技术支持。 |
| 并列题名： | Molecular characterization of Cryptosporidium spp. in Holstein cattle in Yunnan Province and establishment of RAA detection method |
| 题名主题： | 荷斯坦牛 隐孢子虫 基因分型 RAA mRAA 学位论文 |
| 中图分类： | S855.99-533 |
| 个人名称等同： | 衡昭君 著 |
| 个人名称次要： | 杨建发 指导 |
| 个人名称次要： | 邹丰才 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |