书目详细信息
： WWOX 基因在兰坪乌骨绵羊黑色素合成中的功能探究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | WWOX 基因在兰坪乌骨绵羊黑色素合成中的功能探究/.陆颖著/.邓卫东指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.23 |
| 载体形态项： | 75页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物科学技术学院, 学号2020210369 |
| 提要文摘： | 近年来，黑色食品中因富含的黑色素、花青素和类黄酮等被称为人体所需的“超营养素”之一，并列入人类膳食纤维补充剂。花青素和类黄酮存在于植物食品中，黑色素常见于黑米、黑芝麻等植物食品、乌骨鸡以及唯一的哺乳动物兰坪乌骨绵羊，由于高含量黑色素沉积使其具有优势性的营养价值。深度解析兰坪乌骨绵羊高黑色素含量沉积的分子机理，鉴定兰坪乌骨绵羊黑色素相关的功能基因，从而为兰坪乌骨绵羊这一特色地方品种的开发、保护和营养利用提供现实依据。本试验以课题组前期全基因组重测序和转录组分析筛选出的含WW结构域氧化还原酶（WW domain containing oxidoreductase， WWOX ）基因作为候选的致黑基因，采集63只兰坪乌骨绵羊和来自兰坪、会泽的普通绵羊各43只的血液样品，首先通过测定绵羊 TYR 活力、褐黑色素、真黑色素、碱溶性黑色素、总黑色素和血浆比色等指标；分子克隆该基因CDS区并进行生物信息学预测 WWOX 蛋白；PCR扩增 WWOX 基因9个外显子获取多态突变位点，突变位点多态性与6个黑色素含量指标关联分析；同时利用斑马鱼整胚原位杂交技术获得 WWOX 基因的时空表达情况，CRISPR/Cas9技术获得突变体表型，研究该突变体中4个黑色素基因表达情况，主要试验结果如下： 1. 兰坪乌骨绵羊和兰坪普通绵羊、会泽普通绵羊血浆中酪氨酸酶活性分别为496.164±25.313 IU/mL、312.741±20.967 IU/mL、318.594±11.235 IU/mL；褐黑色素含量分别为0.259±0.087 OD/mL、0.172±0.044 OD/mL、0.204±0.0526 OD/mL；真黑色素分别为0.101±0.015 OD/mL、0.083±0.014 OD/mL、0.082±0.014 OD/mL；碱溶性黑色素为0.196±0.046 OD/mL、0.103±0.023 OD/mL、0.188±0.032 OD/mL；血浆比色是0.139±0.071 OD/mL、0.071±0.028 OD/mL、0.067±0.022 OD/mL。其中兰坪乌骨绵羊黑色素的含量指标中酪氨酸酶活性、褐黑色素、真黑色素、血浆比色均极显著（P <0.01）高于两地区普通绵羊；兰坪乌骨绵羊碱溶性黑色素高于兰坪普通绵羊达极显著水平（P <0.01）；三类绵羊群体中总黑色素含量无显著性差异（P ＞0.05）。总黑色素和真黑色素均受绵羊性别的影响，且年龄影响真黑色素含量，两者均具显著性（P <0.05）。 2. 首次获得兰坪乌骨绵羊 WWOX 基因的编码区，序列长1436bp，编码414个氨基酸。蛋白质结构预测得 WWOX 蛋白是主要定位于细胞质中的亲水性非分泌型蛋白。 3. 克隆兰坪乌骨绵羊 WWOX 基因9个外显子，三个群体的序列对比发现存在不同比例的7个突变位点，均为同义突变。统计分析多态位点的基因频率和基因型频率，结果表明兰坪乌骨绵羊和来自兰坪和会泽的普通绵羊间基因型频率均具有差异且达到显著水平（P <0.05），而等位基因频率差异不显著（P >0.05）。Exon2-C19G位点和兰坪乌骨绵羊Exon8-C140T突变点均不处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P >0.05）。兰坪乌骨绵羊和会泽普通绵羊Exon1-C102T未检测出TT基因型，兰坪普通绵羊Exon1-C102T仅检测出CC基因型；两地区普通绵羊在位点Exon6-G72A中均只存在GG基因型。兰坪乌骨绵羊的位点Exon1-C102T和Exon2-C19G、Exon3-A41G、Exon8-C140T、Exon9-A45G和Exon9-G96A位点间高度连锁，Exon3-A41G和Exon6-G72A连锁程度紧密。 4. 绵羊群体中 WWOX 基因的7个同义突变位点与黑色素含量关联分析发现兰坪乌骨绵羊位点Exon1-C102T、Exon8-C140T的CC 和CT 基因型、Exon2-C19G的CC和GG、Exon6-G72A中GG 基因型、Exon3-A41G、Exon9-A45G和Exon9-G96A三个基因型在 TYR 活力、褐黑色素、碱溶性黑色素、真黑色素、血浆比色这五个指标都显著高于两地区普通绵羊（P <0.05）。此外，兰坪乌骨绵羊的优势单倍型为 CCGGCGG ，兰坪普通绵羊的 CCGGCGG 和会泽普通绵羊的 CCAGCGG 为优势单倍型。 5. 斑马鱼整胚原位杂交显示 WWOX 基因表达广泛且不特异，属于非典型色素基因的表达模式，CRISPR 编辑产生的突变体与参考序列拟合度均为0.94，可信度较高，36hpf和48hpf两个gRNA 发挥作用产生67%的indel，36hpf的色素沉积表观上略多于野生型，48hpf的卵黄延伸处和尾部黑色素沉积量明显多于野生型；72hpf仅gRNA1作用的基因编辑后 indel 百分比为 42%，其色素表型存在一定变化。推测 WWOX 基因可能参与黑色素合成过程的调控。 6. 通过qRT-PCR显示，利用CRISPR/Cas9敲除得到的 WWOX+/- 突变体在36h和48h的 TYR 和 TYRP1a 基因表达量升高，达极显著水平（P <0.01），DCT 表达量显著增加（P <0.05）；72h对照组TYR极显著低于敲除型（P <0.01）。表明 WWOX 基因对 TYR、TYRP1a 和 DCT 存在负调控关系。因此， WWOX 基因与相关黑色素基因在表达上存在密切关系。 综上，本次试验首次克隆兰坪乌骨绵羊 WWOX 基因，得到7个同义突变位点，即位点Exon1-C102T、Exon2-C19G、Exon3-A41G、Exon6-G72A、Exon8-C140T、Exon9-A45G和Exon9-G96A，均与黑色素指标存在显著关联，并利用模式生物斑马鱼模型获得表达广泛的整胚原位杂交图，CRISPR/Cas9敲除验证发现初步影响其色素表型，通过qRT-PCR验证 WWOX+/- 与相关黑色素基因间的关系。从分子水平揭示 WWOX 基因与兰坪乌骨绵羊黑色素合成存在一定关系。 |
| 并列题名： | Study on the Function of WWOX Gene in Melanin Synthesis of Lanping Black-boned Sheep |
| 题名主题： | 兰坪乌骨绵羊 黑色素 WWOX基因 原位杂交 CRISPR/Cas9 学位论文 |
| 中图分类： | S813.1-533 |
| 个人名称等同： | 陆颖 著 |
| 个人名称次要： | 邓卫东 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |