书目详细信息
： 八基因异种移植供体猪阳性细胞的筛选及验证
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 八基因异种移植供体猪阳性细胞的筛选及验证/.张大妹著/.魏红江指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.25 |
| 载体形态项： | 55页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物医学院, 学号2021240440 |
| 提要文摘： | 全球首例猪-人心脏移植成功迈出了异种器官移植领域的关键一步。猪-人异种移植面临由分子不相容引起的免疫排斥反应、功能障碍和生物安全三大难题，通过敲除异种抗原和转入人源化相关基因进行编辑是解决上述三大难题最有效的途径，但多基因编辑面临着技术难题大、效率低等问题。因此，获得多基因同时编辑的阳性细胞系尤为重要。 本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除3个抗原（GGTA1、β4GalNT2、CMAH）的同时，利用PiggyBac系统携带5个人源化基因表达载体（hTBM、hCD39、hCD46、hCD55、hCD59）先后4次转染至猪胎儿成纤维细胞，药物筛选后进行T7EN1打靶效率分析，4次转染（A1、B1、A2、B2）的sgRNA平均打靶效率为24.32%，A1、B1、A2、B2打靶效率分别为32.3%、27.81%、21.97%、21.86%。经基因型鉴定，GGTA1基因型为+1bp、-52bp、-127bp等14种，β4GalNT2基因型为-57bp、-158bp、-184bp等12种，CMAH基因型为-2bp、-124bp、-143bp等8种，且hTBM、hCD39、hCD46、hCD55、hCD59基因经PCR鉴定均有转入。通过测序结果进行编辑效率分析，A1的编辑效率为51.33%，B1的编辑效率为46%。将A1进行单克隆培养，共获得25个细胞克隆点，GGTA1基因型为+1bp、-52bp、-13bp/+2bp等10种，β4GalNT2基因型为-57bp、-125bp、-185bp等8种，CMAH基因型为-4bp、-123bp、-124bp等10种。经基因型鉴定，3号和21号细胞克隆点为GGTA1双等位基因敲除，2号、5号、8号和11号细胞克隆点为GGTA1/CMAH双等位基因敲除，12号细胞克隆点为GGTA1/β4GalNT2/CMAH双等位基因敲除，且基因型鉴定的细胞克隆点中hTBM、hCD39、hCD46、hCD55、hCD59基因均有转入。因此，以12号细胞克隆点为供体细胞进行体细胞核移植，代孕母猪妊娠33天时通过外科手术获得1个胎儿，经Sanger测序鉴定GGTA1基因型为-52bp，β4GalNT2基因型为-57bp、-70bp、-125bp、-127bp，CMAH基因型为-4bp、-124bp，经PCR鉴定hTBM、hCD39、hCD46、hCD55、hCD59基因均有转入。通过qPCR检测上述5个人源化基因在胎儿中的mRNA表达水平，其中hCD39/hCD46/hCD55表达极显著高于WT（P<0.01），hTBM/hCD59弱表达。以上结果表明，获得了八基因（GTKO/CMAHKO/β4GalNT2KO/hTBM/hCD39/hCD46/hCD55/hCD59）编辑的阳性供体细胞系及胎儿。 本研究通过CRISPR/Cas9和体细胞核移植获得了六基因编辑（GTKO/hTBM/hCD39/hCD46/hCD55/hCD59）的异种移植供体猪阳性细胞系、七基因编辑（GTKO/CMAHKO/hTBM/hCD39/hCD46/hCD55/hCD59）的异种移植供体猪阳性细胞系以及八基因编辑（GTKO/β4GalNT2KO/CMAHKO/hTBM/hCD39/hCD46/hCD55/hCD59）的异种移植供体猪阳性细胞系和胎儿，为制备多基因编辑异种器官移植供体猪奠定基础，对快速生产多基因编辑猪具有重要的参考价值。 |
| 并列题名： | Screening and Verification of Eight-Genes Edited Porcine Positive Cells for Production of Xenotransplantation Donor Pig eng |
| 题名主题： | 异种器官移植 多基因修饰 CRISPR/Cas9 猪 学位论文 |
| 中图分类： | S852-533 |
| 个人名称等同： | 张大妹 著 |
| 个人名称次要： | 魏红江 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240603 |