书目详细信息
： 纤维素复合酶的构建及其特性研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 纤维素复合酶的构建及其特性研究/.周子健著/.杨舒黎指导 |
| 出版发行项： | 2023.5.26 |
| 载体形态项： | 78页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 动物科学技术学院, 学号2020210372 |
| 提要文摘： | 大额牛为中国唯一的半野生珍稀牛种资源，主食竹子等高纤维物质仍能获得良好的生长和增重；前期研究证实大额牛瘤胃内存在大量的纤维降解菌，能分泌高效降解纤维物质的纤维素酶。为了挖掘高活性的纤维素酶资源，本研究从已构建的大额牛瘤胃微生物宏基因组文库中筛选克隆了两个纤维素酶基因Umcel-1和Umcel-2，对其生物信息学功能分析后，首次使用双启动子系统构建了高活性的纤维素复合酶Umcel-1_Umcel-2，并在E.coli中实现了Umcel-1、Umcel-2和纤维素复合酶Umcel-1_Umcel-2的单一表达和共表达，同时分析了表达产物的酶学性质和对纤维物质的降解特性。主要研究结果如下： 1、从已构建的大额牛瘤胃Fosmid文库中筛选并克隆了2个分类为GH5，碱基长度、等电点和分子量接近，开放阅读框完整以及具有完整纤维素酶结构功能域和活性位点的纤维素酶基因Umcel-1和Umcel-2；通过共表达载体pET30a(+)及双启动子系统成功构建了纤维素复合酶Umcel-1_Umcel-2，该酶具有两个独立的纤维素酶结构功能域。 2、纤维素酶Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2在E.coli BL21中能表达出羧甲基纤维素酶活性。 3、通过SDS-PAGE检测和Western Blot验证，纯化后的纤维素酶Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2的蛋白浓度大小依次为：复合酶Umcel-1_Umcel-2（1.25 mg/mL）> Umcel-1（0.5 mg/mL）> Umcel-2（0.3 mg/mL）。 4、通过对纤维素酶Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶学性质比较分析发现： （1）复合酶Umcel-1_Umcel-2的最适底物浓度与Umcel-1同为2.5%， Umcel-2的最适底物浓度为3.0%。在不同底物浓度（0.5%~4.5%CMC-Na）条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活均极显著高于Umcel-1和Umcel-2的酶活（p<0.001）；在最适底物浓度条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活（203U/mL）是Umcel-1（71U/mL）的2.9倍，是Umcel-2（87U/mL）的2.3倍。 （2）较之Umcel-1和Umcel-2的最适温度为50℃，而复合酶Umcel-1_Umcel-2的最适温度为40℃，接近瘤胃的生理温度（38℃-40℃）。在不同温度（25℃-65℃）条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活均极显著高于Umcel-1和Umcel-2的酶活（p<0.001）；在最适温度条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活（270U/mL）是Umcel-1（112U/mL）的2.4倍，是Umcel-2（109U/mL）的2.5倍。 （3）复合酶Umcel-1_Umcel-2的最适PH 与Umcel-2同为6.5，而Umcel-1的最适PH为6.0。在不同pH（3.0~9.0）条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活均极显著高于Umcel-1和Umcel-2的酶活（p<0.001）；在最适pH条件下，复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活（279U/mL）是Umcel-1（109U/mL）的2.6倍，是Umcel-2（122U/mL）的2.3倍。 （4）以事先置于4℃保存的Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活设定为100%，分别计算各酶在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）水浴保温1h后的相对酶活，观察其热稳定性。结果显示20℃-50℃时，三种酶都具有较强的稳定性，且复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活均极显著高于Umcel-1和Umcel-2的酶活（p<0.001）。 （5）以事先置于4℃保存的Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活设定为100%，分别计算各酶在不同pH Buffer（3.0~10.0）及4℃条件下处理24h后，在最适温度条件下反应15min后的相对酶活。结果显示pH在5.0~7.0时，三种酶都具有较强的稳定性，且复合酶Umcel-1_Umcel-2的酶活均极显著高于Umcel-1和Umcel-2的酶活（p<0.001）。 5、通过对纤维素酶Umcel-1、Umcel-2和复合酶Umcel-1_Umcel-2对多种纤维物质的降解效果比较分析发现：复合酶Umcel-1_Umcel-2对羧甲基纤维素、竹茎、竹叶、稻草干草和苜蓿干草的降解效果均大于Umcel-1和Umcel-2。 |
| 并列题名： | Construction and Characteristics of Cellulosome |
| 题名主题： | 大额牛 纤维素酶基因 共表达 酶学特性 纤维降解 学位论文 |
| 中图分类： | S823-533 |
| 个人名称等同： | 周子健 著 |
| 个人名称次要： | 杨舒黎 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |