书目详细信息
： 川续断中川续断皂苷VI生物合成相关基因功能表征
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 川续断中川续断皂苷VI生物合成相关基因功能表征/.杨润著/.梁艳丽，张广辉指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.20 |
| 载体形态项： | 76页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2020210116 |
| 提要文摘： | 川续断(Dipsacus asperoides)为我国大宗常用中药材续断的唯一基源植物，富含齐墩果烷型三萜皂苷，其活性成分川续断皂苷VI含量极高，可达10%以上。现代医学研究发现川续断皂苷VI不仅具有促进骨损伤愈合、降低子宫收缩、补肝肾等功能，还是一种阿尔茨海默病相关神经炎症的潜在药物，应用前景十分广泛。然而，川续断皂苷VI的来源主要是植物提取，提取过程和基源植物种植受到诸多因素影响，利用代谢工程和合成生物学生产天然化合物是解决该问题的有效手段，川续断皂VI的合成路径解析是实现这一目标的关键。 目前，川续断皂苷VI的合成途径尚未解析，本课题组前期推测其合成涉及的骨架构建与修饰阶段的路径是2,3氧化鲨烯环化形成的β-香树素之后经过CYP450酶两步氧化反应生成常春藤皂苷元，最后经过C-3阿拉伯糖基化和C-28连续两步葡萄糖基化生成川续断皂苷VI，其中C-3的阿拉伯糖基化是整条路径的关键。 本研究以川续断为研究材料，基于转录组测序，对川续断皂苷VI的合成酶相关基因进行了挖掘，通过异源表达首次对川续断皂苷VI合成途径上的基因进行功能表征，主要研究结果如下： （1）通过对川续断转录组的数据分析，从中筛选了13条DaOSCs、14条DaCYPs和11条DaUGTs作为川续断皂苷VI合成相关酶的候选基因。 （2）从川续断的cDNA中成功克隆了11条候选DaOSCs基因，并构建到真核表达载体pYES2中，导入羊毛甾醇缺陷型菌株GIL77。导入了pYES2-DaOSC05和pYES2-DaOSC06的菌株能够产生β-香树素，证明DaOSC05和DaOSC06是β-香树素合酶（βAS）。 （3）在14个候选DaCYPs基因中，有5个DaCYPs是β-香树素C-28氧化酶的候选基因，有9个是齐墩果酸C-23氧化酶的候选基因，有两个同时为C-28和C-23氧化酶的候选基因。这14个候选基因在川续断的cDNA中被成功克隆并构建到真核表达载体Y33中。将带有β-香树素C-28氧化酶候选基因的Y33质粒导入产β-香树素的酵母底盘中发现有两个新的产物产生，初步推测是β-香树素C-23 和C-28以外的位置发生了氧化。将11个含有齐墩果酸C-23氧化酶的候选基因的Y33质粒导入产齐墩果酸的酿酒酵母底盘中发现，DaCYP084、DaCYP085和DaCYP099可以催化齐墩果酸的C-23发生羟化生成常春藤皂苷元，同时在它们的酵母产物中还检测到与Gypsogenin和Gypsogenic acid相同的分子量的产物，结合前人报道的齐墩果酸C-23氧化酶的特征可以初步判断DaCYP084、DaCYP085和DaCYP099在对齐常春藤皂苷元的C-23进行羟化反应后，还能进一步催化醛基化和羧基化反应，分别形成Gypsogenin和Gypsogenic acid。 （4）将10条候选DaUGTs构建到原核表达载体pET-28a上，导入到E. coli BL21 (DE3)中进行蛋白表达并进行纯化，得到了DaUGT016、DaUGT028、DaUGT044、DaUGT045、DaUGT021、DaUGT037和DaUGT059的纯化蛋白，通过体外酶活检测，鉴定了DaUGT044 是UDP-阿拉伯糖基转移酶，以UDP-Ara为糖供体，可以催化常春藤皂苷元C-3位阿拉伯糖基化生成葳岩仙皂苷A，这是萜类合成中第三条被报道的UDP-阿拉伯糖基转移酶。 综上所述，本研究鉴定了川续断中川续断皂苷VI生物合成相关的2个β-香树素合酶（DaOSC05和DaOSC06）、3个齐墩果酸C-23氧化酶（DaCYP084、DaCY0P85和DaCYP099）和1个UDP-阿拉伯糖基转移酶（DaUGT044），另外还有2个DaCYPs（DaCYP065和DaCYP193）的功能需要进一步的确认。这些结果为完整解析川续断皂苷VI生物合成途径奠定了重要基础。 |
| 并列题名： | Functional characterization of Asperosaponin Ⅵ biosynthesis related genes in Dipsacus asperoides C. Y. Cheng et T. M. Ai |
| 题名主题： | 川续断 川续断皂苷VI 2 3氧化鲨烯环化酶 细胞色素P450单加氧酶 糖基转移酶 学位论文 |
| 中图分类： | Q812-533 |
| 个人名称等同： | 杨润 著 |
| 个人名称次要： | 梁艳丽 指导 |
| 个人名称次要： | 张广辉 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |