书目详细信息
： 割手密抗旱基因SsWRKY1的功能鉴定及其互作蛋白NAC家族分析
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY40.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 割手密抗旱基因SsWRKY1的功能鉴定及其互作蛋白NAC家族分析/.沈庆庆著/.李富生指导 |
| 出版发行项： | 2023.6.25 |
| 载体形态项： | 158页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 农学与生物技术学院, 学号2020110027 |
| 提要文摘： | 甘蔗（Saccharum spp.）是最重要的糖和生物能源作物，提供了全球80%的糖产量和40%的乙醇产量。环境胁迫对甘蔗造成的损害可能会产生重大的经济影响，比如甘蔗生长期间的干旱胁迫会使产量降低30%至70%，并将蔗糖形成和蔗糖回收减少5%。通过培育耐旱品种以应对气候变化和环境退化导致的作物产量下降是一种十分有效的方法。然而，甘蔗的遗传背景复杂，生长周期长，与传统杂交育种相比，利用基因工程培育抗性甘蔗品种具有明显的优势。割手密（Saccharum spontaneum L.）是一种甘蔗属野生种适应性很强的物种，具有多种基因表型，可在不同的恶劣环境下生长。作为甘蔗育种亲本，割手密是优良抗性基因的来源，现代甘蔗栽培品种都含有割手密的血缘。因此，从割手密挖掘抗性基因，利用基因工程技术培育抗逆性强的甘蔗新品种具有十分重要的意义。 本研究以割手密转录因子SsWRKY1为研究对象，开展了SsWRKY1基因的分子结构特性分析、功能验证、互作蛋白筛选及其互作蛋白NAC家族分析，主要研究内容和结果如下： (1) 通过构建GFP融合表达载体pC1300NG-SsWRKY1-GFP，瞬时转化烟草鉴定到SsWRKY1蛋白定位在细胞核；利用PLACE数据库搜索到SsWRKY1基因启动子含有ABRE、MBS、ERE、ARE等许多与胁迫相关的顺式作用元件；通过构建自激活检测载体pGBKT7-SsWRKY1，转化到酵母菌株培养显示SsWRKY1不存在自激活活性。利用qRT-PCR分析表明SsWRKY1基因在割手密的所有组织中均有表达；在低温、盐分、病原真菌等胁迫初期SsWRKY1基因呈现迅速下调表达，MeJA激素处理初期表达量也下降，而ABA激素处理初期迅速上调表达。 (2) 构建植物过表达载体pC1300-SsWRKY1，利用花侵法遗传转化拟南芥，潮霉素抗性筛选和PCR检测获得SsWRKY1过表达拟南芥株系。构建植物过表达载体pCAMBIA3300-SsWRKY1、RNAi干扰载体pC3300S-miR-SsWRKY1和CRISPR/Cas9基因编辑载体CPB-WRKY1-Cas9，利用农杆菌介导法将重组载体遗传转化甘蔗栽培种ROC22，经目的基因PCR检测、Bar蛋白检测和qRT-PCR检测获得SsWRKY1过表达甘蔗株系31株、RNAi干扰表达甘蔗株系28株和CRISPR/Cas9基因编辑甘蔗株系37株。 (3) 对SsWRKY1转基因植株进行干旱胁迫鉴定其抗旱能力，发现SsWRKY1过表达拟南芥株系和SsWRKY1过表达甘蔗株系受干旱伤害程度较轻，叶片出现轻微萎蔫卷曲，大部分叶片仍保持正常的叶形和叶色，而WT株系整株失水干枯，叶片失绿，呈现明显的干旱受害症状，同样明显的受害症状在RNAi干扰表达甘蔗株系中也呈现。 (4) 测定干旱胁迫下SsWRKY1转基因植株生理生化指标的变化情况，发现随着干旱胁迫时间的延长，过表达株系脯氨酸的增加量高于WT株系，而丙二醛的含量相比对照WT株系明显减少；抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性随着干旱胁迫时间的延长活性越来越高，而RNAi干扰表达甘蔗株系表现相反的变化，受到干旱胁迫后脯氨酸含量增加幅度小，丙二醛含量急剧增加，并且SOD、POD、CAT等活性受到抑制。 (5) 利用qRT-PCR检测SsWRKY1转基因植株胁迫响应基因的表达变化，发现在干旱胁迫条件下，与野生型WT相比，SsWRKY1过表达拟南芥株系DREB2A、RD29A、RD22、RD29B、ABI5、NCED3等基因的表达显著上调；SsWRKY1转基因甘蔗株系中ROS清除系统基因SOD、POD、CAT、信号传递基因MAPK、脯氨酸生物合成基因P5CS和ABA生物合成的基因NCED在过表达株系中呈现上调表达，而在干扰表达株系中表达水平下调。 (6) 构建重度干旱胁迫的割手密酵母cDNA文库，以SsWRKY1为诱饵蛋白，在割手密酵母双杂交文库中筛选获得21个与SsWRKY1互作的候选蛋白，蛋白注释显示21个蛋白属于光合作用相关蛋白、糖代谢相关蛋白、应激和防御反应蛋白、光诱导蛋白、转录调控蛋白等。GST Pull-down验证表明SsWRKY1与转录调控蛋白ATAF2在体外能够发生相互作用，存在互作关系。 (7) 以与SsWRKY1互作的调控蛋白ATAF2为研究对象，采用生物信息学的方法鉴定其归属的NAC基因家族，发现全基因组水平上割手密含有115个SsNAC基因，分为18个类群，不均匀分布在25条染色体上，结构上N端高度保守的基序与蛋白互作、转录活性和DNA结合能力有关。还发现SsNAC基因在干旱、低温、盐分、病原真菌等胁迫以及ABA和MeJA处理下能够被显著诱导表达。最后，成功克隆得到割手密NAC家族基因SsNAC2、SsNAC3、SsNAC4、ATAF2。 综上所述，本研究验证了割手密转录因子SsWRKY1的抗旱功能，过表达SsWRKY1通过减少丙二醛累积、诱导脯氨酸合成、激活抗氧化酶活性和胁迫响应基因表达提高植物抗旱性，证实SsWRKY1是调节抗旱应答过程中的正调控因子，有望成为作物抗旱遗传改良的候选基因；本研究还初步揭示了SsWRKY1蛋白的互作调控网络，为研究SsWRKY1参与割手密响应干旱胁迫的分子机制提供有价值的信息。 |
| 并列题名： | Functional Characterization and Interaction protein NAC family analysis of the SsWRKY1 Gene Related to Drought Tolerance in Saccharum spontaneum L. eng |
| 题名主题： | 甘蔗 WRKY转录因子 割手密 功能分析 抗旱性 蛋白互作 基因家族鉴定 学位论文 |
| 中图分类： | S566.1-533 |
| 个人名称等同： | 沈庆庆 著 |
| 个人名称次要： | 李富生 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |