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： 塔宾曲霉漆酶的分离纯化及其催化EGCG的研究
书目信息 机读格式(MARC)
| ISBN/价格： | CNY20.00 (估\呈缴)学位论文 |
|---|---|
| 作品语种： | chi |
| 出版国别： | CN 530000 |
| 题名责任者项： | 塔宾曲霉漆酶的分离纯化及其催化EGCG的研究/.王薇著/.王秋萍， 于丽娟指导 |
| 出版发行项： | 2023.06.12 |
| 载体形态项： | 70页:;+图表:;+30cm |
| 一般附注： | 食品科学技术学院, 学号2021240090 |
| 提要文摘： | 普洱茶发酵过程中微生物产生的酶以及酶催化的化学成分变化是影响普洱 茶品质的两个关键因素，且普洱茶品质形成与发酵过程中微生物生物转化密切 相关。前期研究表明，塔宾曲霉作为普洱茶固态发酵过程中的优势菌种，其液 态发酵绿茶水提物合成茶褐素速率是传统固态发酵的 11 倍，但优势真菌塔宾曲 霉分泌的胞外氧化酶漆酶生物转化各种酚类物质合成茶褐素的能力尚不清楚。 因此本文基于 LC-MS/MS 的非靶向代谢组学对塔宾曲霉发酵绿茶水提物合成茶 褐素的过程中，发酵液化学组分的动态变化进行了研究，从而明确参与塔宾曲 霉发酵绿茶水提物合成茶褐素的主要儿茶素类底物；以漆酶活性作为评价指标， 进行塔宾曲霉产漆酶培养基、诱导物（种类、浓度、添加时间）以及培养时间 等单因素筛选，再采用正交实验优化得到塔宾曲霉产漆酶最优条件；在最佳产 漆酶条件下培养塔宾曲霉，获得漆酶粗酶液，依次采用硫酸铵盐析法、膜透析 法、阴离子交换柱方法对漆酶进行提取、纯化，采用凝胶电泳（SDS-PAGE） 进行鉴定，并研究漆酶的 pH 稳定性和热稳定性； 研究不同温度、pH、时间、 酶量对漆酶催化儿茶素 EGCG 生成茶褐素的影响。具体结果如下： 1. 对塔宾曲霉发酵绿茶水提物不同时间段的发酵液进行 LC-MS/MS 检测， 以 OPLS-DA 模型中 VIP≥1 且 T-test P<0.05 作为筛选不同比较组间的差异代谢 物差异阈值，筛选到主要差异代谢物种类为：黄酮类、羧酸及其衍生物类、吲 哚及其衍生物、咪唑嘧啶类、有机氧化合物、有机氮化合物、有机氧化合物、 苯和取代衍生物、嘌呤核苷、醇和多元醇类、1，3-二芳基类丙烷、二苯乙烯类 和其它。其中黄酮类和羧酸及其衍生物类 VIP 值大且差异代谢物多。KEGG 注 释到的通路，富集的代谢物最多的是氨基酸代谢、糖类代谢、辅助因子和维生 素代谢、核苷酸代谢和其他次生代谢物的生物合成等。 塔宾曲霉发酵绿茶水提物过程中，GA 含量持续増加，酯型儿茶素（EGCG、 ECG、CG）呈下降趋势，非酯型儿茶素（EGC、EC、C）呈先上升后下降趋势， 而茶褐素呈上升趋势，由此可知儿茶素类是参与塔宾曲霉发酵绿茶水提物合成 茶褐素的主要底物，而其中 EGCG 在初始发酵液中含量最高，故后续以 EGCG 作为底物，研究塔宾曲霉漆酶催化 EGCG 合成茶褐素的产物特性。 普洱茶发酵过程中微生物产生的酶以及酶催化的化学成分变化是影响普洱茶品质的两个关键因素，且普洱茶品质形成与发酵过程中微生物生物转化密切 相关。前期研究表明，塔宾曲霉作为普洱茶固态发酵过程中的优势菌种，其液 态发酵绿茶水提物合成茶褐素速率是传统固态发酵的 11 倍，但优势真菌塔宾曲 霉分泌的胞外氧化酶漆酶生物转化各种酚类物质合成茶褐素的能力尚不清楚。 因此本文基于 LC-MS/MS 的非靶向代谢组学对塔宾曲霉发酵绿茶水提物合成茶 褐素的过程中，发酵液化学组分的动态变化进行了研究，从而明确参与塔宾曲 霉发酵绿茶水提物合成茶褐素的主要儿茶素类底物；以漆酶活性作为评价指标， 进行塔宾曲霉产漆酶培养基、诱导物（种类、浓度、添加时间）以及培养时间 等单因素筛选，再采用正交实验优化得到塔宾曲霉产漆酶最优条件；在最佳产 漆酶条件下培养塔宾曲霉，获得漆酶粗酶液，依次采用硫酸铵盐析法、膜透析 法、阴离子交换柱方法对漆酶进行提取、纯化，采用凝胶电泳（SDS-PAGE） 进行鉴定，并研究漆酶的 pH 稳定性和热稳定性； 研究不同温度、pH、时间、 酶量对漆酶催化儿茶素 EGCG 生成茶褐素的影响。具体结果如下： 1. 对塔宾曲霉发酵绿茶水提物不同时间段的发酵液进行 LC-MS/MS 检测， 以 OPLS-DA 模型中 VIP≥1 且 T-test P<0.05 作为筛选不同比较组间的差异代谢 物差异阈值，筛选到主要差异代谢物种类为：黄酮类、羧酸及其衍生物类、吲 哚及其衍生物、咪唑嘧啶类、有机氧化合物、有机氮化合物、有机氧化合物、 苯和取代衍生物、嘌呤核苷、醇和多元醇类、1，3-二芳基类丙烷、二苯乙烯类 和其它。其中黄酮类和羧酸及其衍生物类 VIP 值大且差异代谢物多。KEGG 注 释到的通路，富集的代谢物最多的是氨基酸代谢、糖类代谢、辅助因子和维生 素代谢、核苷酸代谢和其他次生代谢物的生物合成等。 塔宾曲霉发酵绿茶水提物过程中，GA 含量持续増加，酯型儿茶素（EGCG、 ECG、CG）呈下降趋势，非酯型儿茶素（EGC、EC、C）呈先上升后下降趋势， 而茶褐素呈上升趋势，由此可知儿茶素类是参与塔宾曲霉发酵绿茶水提物合成 茶褐素的主要底物，而其中 EGCG 在初始发酵液中含量最高，故后续以 EGCG 作为底物，研究塔宾曲霉漆酶催化 EGCG 合成茶褐素的产物特性。2. 采用单因素和正交实验得到塔宾曲霉产漆酶最优条件为：培养基组成为 6%麸皮、6%葡萄糖、1%豆粕粉、0.05% NH4H2PO4、0.2% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.0075% CaCl2，硫酸铜作为诱导物，浓度为 1 mg/mL，培养 24 h 时添加，培养七天，漆酶活性由 6.43 U/mL 增加到了 22.60 U/mL。 3. 纯化后的漆酶比活力活由粗酶时的 96.1 U/mg 上升到了 302.5 U/mg，纯 化倍数是原来的 3.14 倍，回收率达到了 23.0%。经过阴离子交换柱采用 AKTA prime plus 全自动蛋白纯化仪自动收集具有漆酶的活性峰，进行 SDS-PAGE 鉴 定，看到两条清晰的条带，表明漆酶具有两种不同构型，2 个蛋白条带分子量 分别约为 42 KDa 和 34 KDa，最适 pH 为 4，最适温度为 50℃ 。 4. 塔宾曲霉胞外漆酶催化 EGCG 反应后的茶色素产物中，茶褐素与酶量呈 正相关，茶红素与酶量呈负相关，茶黄素在酶量 1500 μL 时生成最多；在 60 和 70℃时茶褐素含量最高，低温 30℃-50℃时茶红素最高；茶褐素、茶红素、茶黄 素都是在 pH=5 时生成量最高。 |
| 并列题名： | Purification of Laccase produced by Aspergillus tubingensis and its catalyzation of EGCG eng |
| 题名主题： | 塔宾曲霉 茶褐素 非靶代谢组学 漆酶 分离纯化 生物转化 学位论文 |
| 中图分类： | TS272.4-533 |
| 个人名称等同： | 王薇 著 |
| 个人名称次要： | 王秋萍 指导 |
| 个人名称次要： | 于丽娟 指导 |
| 团体名称等同： | 云南农业大学 授予 |
| 记录来源： | CN YNAUL 20240301 |