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据此，本文以昆明犬为研究对象，首先测定了200头昆明犬的胆量、兴奋性、衔取欲望、毛色等品种特征性状；进行了全基因组重测序发掘SNPs，开展了SNPs和上述4个特征性状的全基因组关联分析，初步发掘其品种特征性状相关的候选基因；然后采集了4头昆明犬和3头中华田园犬的脑前额叶、嗅球和顶叶组织并进行了转录组测序，寻找与品种特征性状相关的差异表达基因；基于基因组和转录组测序联合分析，发掘出与轴突引导通路相关的重要候选基因；最后对筛选到的关键基因采用独立样品进行其SNPs频率分析，并以斑马鱼为模式动物采用CRISPR/Cas9技术开展基因敲除实验，初步验证功能验证，主要结果如下：

昆明犬的品种特征性状测定和评价

首先我们对昆明犬的胆量、兴奋性、衔取欲望、毛色品种特征性状进行了评分测定，胆量警用性状得分1.965±0.816；兴奋性警用性状得分2.04±0.843；衔取欲望警用性状得分2.251±0.796；毛色警用性状的均值±标准差为1.41±0.914。发现胆量和兴奋性之间程强相关（相关系数r=0.6729），胆量和衔取欲望性状之间程中等强度相关（r=0.5292）；兴奋性和胆量、衔取欲望三者性状之间程强相关（r均大于0.6），但毛色和三种警用行为性状之间存在极弱相关（r值在0.1-0.2间）。

2. 全基因组重测序发掘昆明犬分子遗传标记

全基因组重测序共获得原始数据5.738T，平均测序深度达到7.22×，平均基因组比对率为99.33%。共得到9,918,190个SNPs和1,635,501个Indel，其中约60%SNP-InDel突变位于基因间区，约30%的位于非编码RNA内含子区域。同义突变有42,617个，非同义突变有41,840个。SNPs中碱基发生转换的有6,485,464个，碱基颠倒的有3,432,726个。

3. 全基因组关联分析发掘昆明犬品种特征性状相关功能基因

利用混合线性模型对昆明犬的胆量、兴奋性、衔取欲望、毛色这4个品种特征性状进行了全基因组关联分析，发掘出与胆量性状显著相关的33个候选基因（SLIT3、CAMTA1、FYN、SEMA3C、EFNB2等），主要富集在GO生物学过程中的免疫应答、突触分裂等，KEGG通路富集到轴突发育导向等；发掘出与兴奋性性状显著相关的25个候选基因（ZFR、ZFR、DAB1、EFNB2等），主要富集到心脏内皮向间充质转化调控、突触后神经递质受体内化的调节通路等，KEGG富集到多巴胺能突触、轴突引导等通路；找到与衔取欲望显著关联的34个候选基因（PAK4、NCF1、FUBP1、SVEP1、EPHA5等），主要富集到肌管分化的负调节等，KEGG通路富集到甲状腺激素信号通路、轴突引导、胆碱能突触等；最后还发掘出与毛色显著关联的33个候选基因（SLC17A8、ROBO2、FGF5、MC1R、ASIP等），GO主要富集到黑皮质素受体结合，KEGG通路分析结果富集在酪氨酸蛋白激酶、黑色素生成等通路中。总体富集分析发现EFNB2、FYN、SEMA3、SLIT3、EPHA5、PAK4、PIK3CD、ROBO2等基因均显著富集到轴突引导的信号通路中。轴突引导发育是神经元网络形成的关键阶段，由生长锥受体搭载引导线索通过下游受体的信号转导途径决定了生长锥发育方向，据此推断轴突引导的通路涉及的候选基因对于昆明犬品种特征性状的形成非常关键。通过三种特征性状候选基因交互分析得到影响胆量和兴奋性品种特征性状的3个基因（CAMTA1、CD48、EFNB2），得到1个影响兴奋性、衔取欲望品种特征性状的基因CABLES2，也均富集到轴突引导的通路中。

昆明犬与中华田园犬差异表达基因分析

昆明犬和中华田园犬3个部位脑组织转录组测序共获得136.28Gb Clean数据。对于脑前额叶组织，昆明犬和中华田园犬之间筛选出差异表达基因（DEGs）有3,208个，其中1,351个上调基因，1,857个下调基因；在嗅球组织，筛选到DEGs8,024个，其中3,525个上调基因，4,499个下调基因；在顶叶组织，筛选到DEGs 4,599个，其中上调基因1,776个，下调基因2,823个。对三个部位DEGs进行数据库的功能注释均富集到转化生长因子受体信号、轴突延伸、神经元突触可塑性、嗅觉传导的调节等通路。三个部位找到的DEGs在KEGG分析中均富集在阿尔茨海默病、亨廷顿病、多巴胺能神经突触、胆碱能突触、嗅味觉传导、皮质醇合成分泌等通路。通过对比昆明犬和中华田园犬的嗅球DEGs，发现ADCY1、ADCY3、ADCY5、CAMK2A、PRKX这5个基因均富集到嗅觉传导信号通路上。

基因组和转录组联合分析鉴定昆明品种特征性状的重要候选基因

将全基因组关联分析中得到的与品种特征性状显著相关的候选基因与转录组测序挖掘到的DEGs进行联合交互分析，筛选出影响胆量特征性状的关键候选基因13个（BPGM、CACNA2D1、CD48、EFNB2、FAM207A、FYN、MYO16、RPF2、SCFD1、SEC22A、SEMA3C、CALCRL、CD48、DAB1、EFNB2、PSTPIP1、ZNF706）；筛选到影响兴奋性特征性状的关键候选基因6个（CALCRL、CD48、DAB1、EFNB2、PSTPIP1、ZNF706）；筛选到影响衔取欲望特征性状的关键候选基因有10个（ABCA5、AIF1L、CTNNA3、DPP8、EPHA5、IGSF21、NCOA4、PAK4、PLPP7、PRDM15）；筛选到影响毛色特征性状的2个关键候选基因PMEL和ROBO2。其中EFNB2能够与EPHA5等受体结合调节轴突的排斥性引导，参与中枢神经系统的发育，影响前脑中调节胼胝体纤维穿越中线的作用。SLIT3配体与ROBO2受体结合调节轴突引导，参与海马神经元发育、调节海马形态和学习记忆能力。FYN参与突触可塑性和认知功能的调节，影响学习记忆能力和精神疾病的发生。SEMA3C参与神经管形成、神经元迁移、突触形成和可塑性，对空间记忆和恐惧条件化等学习能力有影响。因此将富集在轴突引导发育通路中EFNB2、SLIT3、FYN、SEMA3C、EPHA5、ROBO2这6个基因作为影响昆明犬品种特征性状的重要候选基因进行下一步功能验证实验。

昆明犬品种特征性状候选基因的功能验证

另外测定325头昆明犬的品种特征性状，选取排名前20%和后20%的两组样品各65头，在SNPs位点上下游约300 bp测序分析等位基因频率，结果表明FYN、ROBO2的突变基因型在排名前20%组中均是优势基因型（P＜0.05）；SLIT3、EPHA5的突变基因型是排名前20%组的极显著优势基因型（P＜0.01）。为进一步验证关键候选基因的mRNA表达，通过另外测定3头昆明犬的脑顶部组织轴突引导通路上6个差异基因的mRNA相对表达量，与3头中华田园犬对比，发现EFNB2、EPHA5、SEMA3C、SLIT3基因在昆明犬中极显著高表达（P<0.01），在嗅觉传导通路上的差异基因CAMK2A、PRKX、ADCY1在昆明犬中极显著高表达（P<0.01）；ADCY3和ADCY5基因在昆明犬中显著高表达（P＜0.05）。最后应用CRISPR/Cas9系统对SLIT3、EPHA5、SLC17A8在斑马鱼上进行逐一敲除，观测受精后30 hpf、48 hpf和72 hpf脑部发育状况并检测相关基因表达量。与野生型斑马鱼对比发现ROBO1、ROBO2、DCC、PAK4基因在Slit3+/-斑马鱼不同发育时期高表达且差异极显著（P<0.01），FYN基因在Slit3+/-斑马鱼中低表达且差异极显著（P<0.01）。与野生型斑马鱼对比发现Epha5+/-斑马鱼中DCC、EFNB2、FYN基因在不同发育时期均极显著高表达（P<0.01）。Slit3+/-斑马鱼在30 hpf小脑部分缺失、48 hpf后脑发育异常；Epha5+/-斑马鱼在30 hpf在中脑-后脑边界部分缺失和异常，48 hpf时期后脑早期发育菱形边界形成异常；72 hpf突变嵌合体斑马鱼均出现心包发育水肿；突变胚胎存在死亡率高、发育迟缓、尾巴弯曲、心包水肿和发育畸形等问题，证实了SLIT3、EPHA5基因影响中脑和后脑、轴突发育和形态维持。另外在SLC17A8+/-斑马鱼与野生型斑马鱼对比时还发现，30 hpf和72 hpf时SLC17A8+/-斑马鱼卵黄和脊背部黑色素量明显少于野生型，说明该基因极有可能控制了毛色性状。

综上所述，本文首次从基因组学和转录组学两大层面对昆明犬这一个唯一国产警用工作犬的胆量、兴奋性、衔取欲望、毛色品种特征性状进行了系统全面的遗传解析，发现了影响轴突引导通路上EFNB2、SLIT3、FYN、SEMA3C、EPHA5、ROBO2这6个基因在调节昆明犬轴突神经元、脑发育和神经网络功能方面发挥重要作用推测其影响警用行为。随后利用CRISPR/Cas9等技术进一步发现SLIT3和EPHA5基因是的参与轴突引导通路影响大脑中的蛋白表达与神经元的分化、突触形成、脑的发育有关的最重要的候选基因，进而影响到昆明犬胆量、兴奋性、衔取欲望等工作记忆学习能力，因此可以将SLIT3和EPHA5基因作为昆明犬品种特征性状的分子标记开展选育，这为国内警用工作犬品种的选育提升提供了新的思路和依据。